Studio della patologia da Alpha-synucleina in modelli sperimentali di ictus ischemico

Stroke remains one of the leading causes of death and disability worldwide, with limited therapeutic options. Vascular damage and inflammation correlate with stroke severity and worse outcomes in patients. Alpha-synuclein (α-syn), a neuronal protein widely known for its pathogenic role in chronic neurodegenerative diseases, such as PD, has been described to be also involved in acute brain damage following stroke. However, how α-syn contributes to stroke pathology remains to be fully understood. Here, we investigated the hypothesis that ischemia-induced α-syn pathology contributes to brain damage by influencing vascular inflammation and angiogenesis after experimental stroke. Focal transient cerebral ischemia was induced in C57BL/6RCC wild-type and C57BL/6S null mice with spontaneous deletion of α-syn by unilateral transient occlusion of the middle cerebral artery (tMCAo) for 30 minutes. At 9 days we evaluate sensorimotor deficit with De Simoni neuroscore, to assess the health state of the animals and focal deficits that are strictly related to ischemic outcomes. Null mice showed an increase in the survival rate compared to the wild-type mice. Mice were subjected to MRI analysis on days 3 and 7 post-surgery to evaluate the differences in lesion volume: null mice showed bigger lesions and an intrinsic tendency to have bigger total brain volume, probably due to the importance of α-syn during development. To characterise the long-term impact of α-syn after the ischemic event, EPM and BARNES tests were performed after respectively 28 and 35 days, but we didn’t observe any significant difference, in line with the hypothesis that the lack of α-syn is protective and null mice maintain similar overall stress response and spatial learning memory. To evaluate the effect of ischemic conditions on α-syn structure and function, we performed an in vitro aggregation assay and CD analysis. We observed in an acidic pH the presence of forming seeds of α-syn that interacted with monomeric protein interfering with its normal function. We studied the effect of potential candidate therapeutic compounds, such as clusterin and doxycycline, in our in vitro ischemia-reperfusion model. We observed that the treatment inhibited the aggregation of α-syn in seeds. Our preliminary results could lead to the development of novel possible therapeutic approaches in the acute phase of ischemic stroke.

L’ictus continua a rappresentare una delle principali cause di morte e disabilità a livello mondiale, con opzioni terapeutiche ancora limitate. Il danno vascolare e l'infiammazione sono correlati con una maggiore gravità dell’ictus e con esiti clinici peggiori nei pazienti. L’alfa-sinucleina (α-syn), una proteina neuronale ampiamente nota per il suo ruolo patogeno nelle malattie neurodegenerative croniche, come il morbo di Parkinson, è coinvolta anche nel danno cerebrale acuto che segue un ictus ischemico, modulando il danno vascolare e i processi di recupero. In questo studio abbiamo analizzato, in un modello in vivo di ictus ischemico, l’impatto delle forme patologiche dell’α-syn sul danno cerebrale e sul recupero della lesione ischemica nelle sue fasi acute, sub-acute e croniche. Abbiamo inoltre sviluppato un modello in vitro non cellulare di aggregazione dell’α-syn in condizioni che mimano l’ischemia per testare l’effetto di potenziali composti/farmaci terapeutici. Per lo studio in vio, l’ischemia cerebrale focale transitoria è stata indotta in topi wild-type C57BL/6RCC e in topi C57BL/6S con delezione spontanea dell’α-syn mediante occlusione transitoria unilaterale dell’arteria cerebrale media (tMCAo) per 30 minuti. I topi sono stati valutati per i deficit sensorimotori al giorno 9 tramite una scala di valutazione chiamata neuroscore, per il fenotipo ansioso e la funzionalità locomotoria generale al giorno 28 tramite EPM (elevated plus maze), per l’apprendimento spaziale e la memoria ai gironi 30-35 tramite il test del labirinto di Barnes e per la sopravvivenza fino all’endpoint sperimentale. La risonanza magnetica (MRI) è stata utilizzata per analizzare longitudinalmente la dimensione dell’infarto, l’emodinamica e l’edema cerebrale. Abbiamo osservato una maggiore sopravvivenza complessiva nei topi knock-out, nonostante deficit sensorimotori comparabili nella fase sub-acuta della tMCAo. Tuttavia, i topi knock out per α-syn hanno mostrato la riduzione del tempo trascorso nella zona centrale dell’apparato EPM, suggerendo un comportamento esplorativo alterato, e un apprendimento compromesso rispetto ai controlli sham nel test del labirinto di Barnes. Questi dati suggeriscono che l’assenza della α-syn endogena predisponga i topi ad una maggiore sensibilità all’ictus ischemico. In linea con questa osservazione, i topi non esprimenti α-syn hanno mostrato lesioni più estese, un deficit nel flusso cerebrovascolare e un edema cerebrale più esteso rispetto ai topi wild-type nell’analisi MRI a 3 giorni dalla tMCAo. Tuttavia, questi topi hanno mostrato un marcato recupero in tutti i parametri a 7 giorni, quando i valori MRI sono tornati simili a quelli misurati nei topi wild type. Questa osservazione suggerisce che esista un effetto temporale legato alla α-syn nella fisiopatologia del danno ischemico. In particolare, mentre le forme monomeriche fisiologiche sono importanti nel supportare le funzioni vascolari, quelle aggregate patologiche, che si formano a seguito dello stimolo ipossico, contribuiscono al danno cerebrovascolare. Per valutare il ruolo distinto della α-syn endogena (monomerica) e di quella tossica (aggregata) sulla vascolatura cerebrale, abbiamo utilizzato un modello in vitro di ipossia/riossigenazione in cellule endoteliali microvascolari. In breve, le cellule sono state esposte alla α-syn monomerica all’inizio del periodo di ipossia o durante la ripresa della riossigenazione. Abbiamo osservato che la prima condizione, in cui α-syn veniva aggiunta durante l’ipossia, induceva un aumento di ICAM-1, un mediatore infiammatorio, da parte delle cellule microvascolari. Al contrario, l’aggiunta di α-syn nel periodo di riossigenazione permetteva una riduzione di ICAM-1.