Analisi in vitro e in vivo di varianti missenso della DNA polimerasi η

Translesion synthesis (TLS) is one of the strategies that allows to bypass DNA damage, thus allowing the replication process to continue and the completion of the cell cycle. Polymerase η (Polη) is a key enzyme in the TLS process. Mutations in the POLH gene, which encodes this polymerase, can impair its function and are associated with the rare genetic disease Xeroderma Pigmentosum Variant (XPV). The variants of Polη most frequently associated with XPV are those clearly pathogenic, often represented by nonsense or frameshift mutations, which significantly impair the function of the enzyme or abolish the expression of the polymerase. However, many missense variants identified in patients remain classified as "variants of uncertain significance" (VUS), due to the lack of precise functional characterization. In particular, most of the available studies are based on patient-derived cells, which introduces variables that are difficult to control. In this work we analysed fifteen missense variants of Polη in vitro, eight of which also in vivo, using an experimental system based on XP30RO cells, devoid of Polη, complemented with the Polη variants under study. The results show a wide heterogeneity of behaviour: the mutations seem to be involved in the variation in the enzymatic activity of the protein, its regulation, stability or protein interactions. In particular, it was observed that six variants (Arg93Pro, Arg111His, Ala117Pro, Thr122Pro, Gly263Val, Cys321Phe) show significant defects and we propose that their classification to be changed, according to the ACMG guidelines, from “VUS” to "likely pathogenic". The variants Lys535Glu and Met595Val, on the contrary, present a complex behaviour, therefore should remain classified as VUS, requiring further studies and experiments. This work is part of a larger project aimed at the functional characterization of Polη variants, trying to help diagnose Xeroderma Pigmentosum Variant cases with certainty in the presence of new missense mutations in the different functional domains of Polη.

La sintesi translesione (TLS) è una delle strategie che permette di bypassare il danno al DNA, consentendo alla cellula di continuare il processo di replicazione e completare il ciclo cellulare. La polimerasi η (Polη) è un enzima fondamentale nel processo di TLS. Mutazioni nel gene POLH, che codifica per questa polimerasi, possono compromettere la sua funzione e sono associate alla malattia genetica conosciuta come Xeroderma Pigmentoso Variante (XPV). Le varianti di Polη più frequentemente riportate associate a XPV sono quelle chiaramente patogene, spesso rappresentate da mutazioni nonsenso o frameshift, che compromettono significativamente la funzione dell'enzima. Tuttavia, molte varianti missenso identificate nei pazienti rimangono classificate come "varianti di significato incerto" (VUS), a causa dell’assenza di una caratterizzazione funzionale precisa. In particolare, la maggior parte degli studi disponibili si basa su cellule derivate da pazienti, il che introduce variabili difficili da controllare. In questo lavoro abbiamo analizzato quindici varianti missenso di Polη in vitro, otto delle quali anche in vivo, utilizzando un sistema sperimentale basato su cellule XP30RO, prive di Polη, in cui abbiamo ri-espresso le varianti di Polη oggetto dello studio. I risultati mostrano un’ampia eterogeneità di comportamento: le mutazioni sembrano essere coinvolte nella variazione nell’attività enzimatica della proteina, la sua regolazione, la stabilità o le interazioni proteiche. In particolare, è stato osservato che sei varianti (Arg93Pro, Arg111His, Ala117Pro, Thr122Pro, Gly263Val, Cys321Phe) mostrano difetti significativi nella sintesi translesione e sarebbe possibile cambiare la loro classificazione, secondo le linee guida dell’ACMG, da “VUS” a "likely pathogenic" in quanto direttamente responsabili della malattia. Le varianti Lys535Glu e Met595Val, al contrario, presentano un comportamento complesso che necessita di ulteriori studi ed esperimenti, rimanendo perciò classificate come VUS. Questo lavoro si inserisce in un progetto più ampio volto alla caratterizzazione funzionale delle varianti di Polη, cercando di aiutare a diagnosticare con certezza i casi di Xeroderma Pigmentoso Variante in presenza di nuove mutazioni missenso nei diversi domini funzionali di Polη.