Coinvolgimento dei canali ionici nel processo di migrazione cellulare in cellule bipolari U251 di Glioblastoma Multiforme

Il glioblastoma multiforme (GBM) è l'astrocitoma più comune e aggressivo negli esseri umani. Solo il 30% dei pazienti affetti da questo tumore sopravvive un anno dopo la diagnosi, con un’aspettativa di vita di circa 15 mesi. Le attuali strategie terapeutiche includono l’intervento chirurgico, la radioterapia e/o chemioterapia. Proprio per la difficoltà nello stabilire una terapia efficacie, è necessaria una comprensione più approfondita dei meccanismi cellulari e molecolari alla base dell’insorgenza e dello sviluppo di questa neoplasia, con particolare attenzione ai meccanismi alla base dei fenomeni di migrazione cellulare. Questo elaborato di tesi è stato sviluppato con l’intento di proseguire e rafforzare il lavoro presentato in articoli precedentemente pubblicati dal Laboratorio di Neurobiologia e Fisiologia Integrata, diretto dalla Prof.ssa Rossi, presso cui ho svolto la mia esperienza di internato. In tali articoli, sono state analizzate le proprietà elettrofisiologiche delle cellule della linea cellulare tumorale di glioblastoma umano U251 in diverse posizioni rispetto allo scratch (inside scratch ed outside scratch) successivamente all’induzione della migrazione cellulare mediante il saggio di migrazione bidimensionale noto come Wound healing assay. Nel presente elaborato di tesi si è innanzitutto studiato, attraverso la tecnica di microscopia time-lapse, il processo migratorio e il comportamento cellulare delle cellule di GBM in relazione alla loro posizione rispetto allo scratch. La microscopia in time-lapse è una tecnica fotografica automatizzata che consente l’acquisizione di immagini a intervalli regolari per lunghi periodi di tempo, fornendo informazioni sullo sviluppo, sul comportamento e sulla capacità migratoria delle cellule. I risultati ottenuti hanno dimostrato che le cellule localizzate ai bordi dello scratch (edge scratch) sono quelle “committed”, ovvero deputate alla migrazione. Identificate le cellule coinvolte nella migrazione, l’attenzione è stata rivolta allo studio delle loro proprietà elettrofisiologiche, con particolare attenzione alle correnti inward e outward rectifier. Le analisi elettrofisiologiche sono state svolte tramite la tecnica Patch clamp, in modalità Voltage clamp, utilizzando la configurazione del perforated-patch, che consente di studiare i canali ionici in condizioni fisiologiche. Nelle cellule edge scratch è stata individuata una nuova corrente inward rectifier non ancora descritta in letteratura, per questo motivo si è deciso di approfondire l’analisi attraverso una prima caratterizzazione cinetica. La corrente inward rettificante registrata nelle cellule edge scratch ha mostrato una particolare relazione corrente/voltaggio non compatibile con una corrente voltaggio-dipendente, suggerendo il possibile coinvolgimento del trasportatore Na+/Ca2+ (NCX). Per verificare questa ipotesi, il trasportatore NCX è stato inibito mediante bloccanti specifici, come Bepridil (100 µM) e Nichel (1 mM), che hanno causato una significativa riduzione dell’ampiezza della corrente. Alla luce dei risultati ottenuti si è voluto validare ulteriormente l’ipotesi del coinvolgimento del trasportatore NCX nel processo di migrazione cellulare. Utilizzando nuovamente la microscopia time-lapse, è stato dimostrato che il blocco di NCX mediante Nichel provoca un rallentamento statisticamente significativo della migrazione cellulare.