Sviluppo di un nuovo test diagnostico PCR per l'intolleranza al lattosio

Lactose intolerance is a globally widespread condition, mainly caused by a reduction in lactase enzyme activity, often associated with the C/T -13910 polymorphism located in the MCM6 regulatory gene. Currently, clinical diagnosis is based on biochemical methods such as the breath test, which have limitations related to specificity, tolerability and accuracy. The aim of this thesis was to develop and validate a molecular diagnostic protocol based on PCR (Polymerase Chain Reaction) for the rapid, sensitive and non-invasive identification of the LCT-13910 C/T polymorphism. The experimental work was conducted at the Laboratory of Molecular Diagnostics (LDM) in Lugano, in an ISO/IEC 17025-compliant environment. A PCR-RFLP protocol was optimised, which included DNA extraction from peripheral blood, amplification of the target segment using specific primers and enzymatic digestion with BsmFI for genotypic discrimination of the three possible genotypic variants: CC (tolerance), CT (partial tolerance) and TT (intolerance). Optimisation of PCR conditions identified an ideal annealing temperature of 58 °C and an optimal DNA volume of 10 µL, ensuring high specificity and sensitivity of the test. The effectiveness of the protocol was validated through internal audits, inter-laboratory comparisons with accredited facilities and participation in external quality assessment programmes (EQA). The results obtained confirm the robustness of the method, the reproducibility of the results and the possibility of clearly distinguishing allele profiles by agarose gel electrophoresis. The proposed protocol represents a valid alternative to phenotypic tests, with the advantage of being less invasive, quicker and suitable even for laboratories with limited technological resources. Moreover, the genetic test can be performed only once in a patient's lifetime, providing stable and definitive information. This study contributes to strengthening the integration of molecular diagnostics in daily clinical practice and supports the application of personalised medicine in the context of food intolerances.

L'intolleranza al lattosio è una condizione diffusa a livello globale, causata principalmente da una riduzione dell'attività dell'enzima lattasi, spesso associata al polimorfismo C/T -13910 situato nel gene regolatore MCM6. Attualmente, la diagnosi clinica si basa su metodi biochimici come il breath test, che presentano limiti legati a specificità, tollerabilità e accuratezza. Lo scopo di questa tesi è stato quello di sviluppare e validare un protocollo diagnostico molecolare basato sulla PCR (Polymerase Chain Reaction) per l'identificazione rapida, sensibile e non invasiva del polimorfismo C/T LCT-13910. Il lavoro sperimentale è stato condotto presso il Laboratorio di Diagnostica Molecolare (LDM) di Lugano, in un ambiente conforme alla norma ISO/IEC 17025. È stato ottimizzato un protocollo PCR-RFLP che comprendeva l'estrazione del DNA dal sangue periferico, l'amplificazione del segmento target mediante primer specifici e la digestione enzimatica con BsmFI per la discriminazione genotipica delle tre possibili varianti genotipiche: CC (tolleranza), CT (tolleranza parziale) e TT (intolleranza). L'ottimizzazione delle condizioni di PCR ha identificato una temperatura di annealing ideale di 58 °C e un volume ottimale di DNA di 10 µL, garantendo un'elevata specificità e sensibilità del test. L'efficacia del protocollo è stata convalidata attraverso audit interni, confronti interlaboratorio con strutture accreditate e partecipazione a programmi esterni di valutazione della qualità (EQA). I risultati ottenuti confermano la robustezza del metodo, la riproducibilità dei risultati e la possibilità di distinguere chiaramente i profili allelici mediante elettroforesi su gel di agarosio. Il protocollo proposto rappresenta una valida alternativa ai test fenotipici, con il vantaggio di essere meno invasivo, più rapido e adatto anche a laboratori con risorse tecnologiche limitate. Inoltre, il test genetico può essere eseguito una sola volta nella vita del paziente, fornendo informazioni stabili e definitive. Questo studio contribuisce a rafforzare l'integrazione della diagnostica molecolare nella pratica clinica quotidiana e sostiene l'applicazione della medicina personalizzata nel contesto delle intolleranze alimentari.