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Myasthenia gravis (MG) is an autoimmune disease, T-cell dependent and B-cell-mediated, characterized by weakness and fatigability of skeletal muscles due to impaired neuromuscular junction (NMJ) function. In the last years, many drugs have been proposed for the treatment of MG, and it has been authorized the use of Efgartigimod, a human recombinant IgG1 antibody fragment, that binds the neonatal Fc receptor (FcRn) and blocks the IgG recycling. Thus, the level of circulating autoantibodies decreases, leading to clinical benefits in MG patients. Since the FcRn is expressed not only on endothelial cells of vessels, but also on immune cells, the aim of this study was to investigate if Efgartigimod could have any immunological effects, beyond its established role in IgG reduction. The research particularly focused on splenic lymphoid cells in an experimental model of MG (EAMG), by integrating cellular and molecular approaches. EAMG was induced in mice by multiple subcutaneous injections of purified Torpedo californica AChR (TAChR) and Efgartigimod or PBS was administered biweekly intraperitoneally after the second boost. Clinical evaluations were performed to assess the severity of symptoms until the end of the experiment. Ex vivo analysis was conducted to quantify circulating anti-AChR antibodies in serum and muscle AChR content in Efgartigimod-treated mice and PBS-EAMG mice. Flow cytometry was conducted to assess any variations in the percentage of naïve, effector memory, and central memory for the T cells lineage (CD4 and CD8). Germinal center B cells, plasma cells, and long-lived plasma cells were selected for the B cell lineage. Additionally, selected miRNAs (miR-150, miR-146a, and miR-486) were isolated, and expression levels were compared among the EAMG group, Efgartigimod-treated mice, and healthy controls. Moreover, the expression of the mRNA target was analyzed. Results demonstrated the efficacy of Efgartigimod in dampening the clinical symptoms of EAMG, and a lower concentration of anti-AChR antibodies was detected in the serum of Efgartigimod-treated mice. In parallel, a higher content of muscle AChR was found in treated mice. This data demonstrated the effectiveness of an anti-FcRn in ameliorating EAMG. Flow cytometry analysis on splenocytes revealed an increase in CD8+ T cells and a decrease in CD19+B220+ B cells. Interestingly, data revealed a higher percentage of plasma cells (CD138 + TACI +) and long-lived plasma cells (CD138+TACI + CD19-B220-) in Efgartigimod-treated mice compared to PBS-EAMG. Because this increase was not associated with an increase in anti-AChR antibodies, it could be argued that these plasma cells may have a non-pathogenic phenotype with immunoregulatory properties. Expression profiling of miRNA revealed that even if all of them were increased in EAMG mice, only miR-150 was significantly higher. Efgartigimod treatment seemed to restore the expression of miR486 significantly to the HD level. No differences were observed in mRNA expression levels of IRAK and TRAF6 (targets of miR-146a), SMAD2 and PTEN (target of miR-486), and FOXP1 and MYB (targets of miR-150). These findings demonstrate that Efgartigimod not only decreases pathogenic IgG levels but also acts on other immune mechanisms. To better outline the secondary effects of the anti-FcRn administration, additional studies should be conducted to clarify the mechanisms of action of Efgartigimod on B cells differentiation in PC and extend the analysis to more miRNA involved in the immune response. Keywords: Myasthenia Gravis (MG), Autoimmune disorder, Flowcytometry, MicroRNA.

La miastenia gravis (MG) è una malattia autoimmune, dipendente dai linfociti T e mediata dai linfociti B, caratterizzata da debolezza e affaticamento dei muscoli scheletrici a causa di un malfunzionamento della giunzione neuromuscolare (NMJ). Negli ultimi anni, sono stati proposti numerosi farmaci per il trattamento della MG ed è stato autorizzato l’uso di Efgartigimod, un frammento di anticorpo umano ricombinante IgG1, che si lega al recettore neonatale Fc (FcRn) e blocca il riciclo delle IgG. Di conseguenza, diminuisce il livello di autoanticorpi circolanti, portando a benefici clinici nei pazienti affetti da MG. Poiché il FcRn è espresso non solo sulle cellule endoteliali dei vasi, ma anche sulle cellule immunitarie, lo scopo di questo studio è stato indagare se Efgartigimod potesse avere effetti immunologici, oltre al suo ruolo consolidato nella riduzione delle IgG. La ricerca si è concentrata in particolare sulle cellule linfoidi spleniche in un modello sperimentale di MG (EAMG), integrando approcci cellulari e molecolari. L’EAMG è stato indotto nei topi mediante multiple iniezioni sottocutanee di recettore ACh della Torpedo californica purificato (TAChR), e Efgartigimod o PBS sono stati somministrati per via intraperitoneale due volte a settimana dopo il secondo richiamo. Sono state effettuate valutazioni cliniche per determinare la gravità dei sintomi fino al termine dell’esperimento. Sono state condotte analisi ex vivo per quantificare gli anticorpi anti-AChR circolanti nel siero e il contenuto di AChR muscolare nei topi trattati con Efgartigimod e nei topi EAMG trattati con PBS. La citometria a flusso è stata impiegata per valutare eventuali variazioni nella percentuale di cellule T naive, di memoria effettrice e di memoria centrale (CD4 e CD8). Per la linea cellulare B, sono state selezionate le cellule del centro germinativo, le plasmacellule e le plasmacellule a lunga vita. Inoltre, sono stati isolati alcuni miRNA selezionati (miR-150, miR-146a e miR-486) e i livelli di espressione sono stati confrontati tra il gruppo EAMG, i topi trattati con Efgartigimod e i controlli sani. È stata anche analizzata l’espressione dei bersagli mRNA. I risultati hanno dimostrato l’efficacia di Efgartigimod nel ridurre i sintomi clinici dell’EAMG, e nei topi trattati è stata rilevata una concentrazione più bassa di anticorpi anti-AChR nel siero. Parallelamente, è stato osservato un maggiore contenuto di AChR muscolare nei topi trattati. Questi dati hanno dimostrato l’efficacia dell’anti-FcRn nel migliorare l’EAMG. L’analisi tramite citometria a flusso delle cellule spleniche ha rivelato un aumento delle cellule T CD8+ e una diminuzione delle cellule B CD19+B220+. Interessantemente, i dati hanno mostrato una percentuale più elevata di plasmacellule (CD138+TACI+) e di plasmacellule a lunga vita (CD138+TACI+CD19-B220-) nei topi trattati con Efgartigimod rispetto ai topi EAMG trattati con PBS. Poiché tale aumento non era associato a un aumento degli anticorpi anti-AChR, si può ipotizzare che queste plasmacellule possano avere un fenotipo non patogeno con proprietà immunoregolatorie. Il profilo di espressione dei miRNA ha rivelato che, sebbene tutti fossero aumentati nei topi EAMG, solo il miR-150 mostrava un aumento significativo. Il trattamento con Efgartigimod sembrava ripristinare significativamente l’espressione di miR-486 al livello dei controlli sani. Non sono state osservate differenze nei livelli di espressione dell’mRNA di IRAK e TRAF6 (bersagli del miR-146a), SMAD2 e PTEN (bersagli del miR-486), e FOXP1 e MYB (bersagli del miR-150).

Blocco del recettore Fc neonatale nel modello sperimentale di Miastenia Gravis: studi ex vivo per valutare gli effetti secondari sulle cellule linfoidi spleniche.

RAZAVI KHANKAHDANI, FATEMEHOSSADAT
2024/2025

Abstract

Myasthenia gravis (MG) is an autoimmune disease, T-cell dependent and B-cell-mediated, characterized by weakness and fatigability of skeletal muscles due to impaired neuromuscular junction (NMJ) function. In the last years, many drugs have been proposed for the treatment of MG, and it has been authorized the use of Efgartigimod, a human recombinant IgG1 antibody fragment, that binds the neonatal Fc receptor (FcRn) and blocks the IgG recycling. Thus, the level of circulating autoantibodies decreases, leading to clinical benefits in MG patients. Since the FcRn is expressed not only on endothelial cells of vessels, but also on immune cells, the aim of this study was to investigate if Efgartigimod could have any immunological effects, beyond its established role in IgG reduction. The research particularly focused on splenic lymphoid cells in an experimental model of MG (EAMG), by integrating cellular and molecular approaches. EAMG was induced in mice by multiple subcutaneous injections of purified Torpedo californica AChR (TAChR) and Efgartigimod or PBS was administered biweekly intraperitoneally after the second boost. Clinical evaluations were performed to assess the severity of symptoms until the end of the experiment. Ex vivo analysis was conducted to quantify circulating anti-AChR antibodies in serum and muscle AChR content in Efgartigimod-treated mice and PBS-EAMG mice. Flow cytometry was conducted to assess any variations in the percentage of naïve, effector memory, and central memory for the T cells lineage (CD4 and CD8). Germinal center B cells, plasma cells, and long-lived plasma cells were selected for the B cell lineage. Additionally, selected miRNAs (miR-150, miR-146a, and miR-486) were isolated, and expression levels were compared among the EAMG group, Efgartigimod-treated mice, and healthy controls. Moreover, the expression of the mRNA target was analyzed. Results demonstrated the efficacy of Efgartigimod in dampening the clinical symptoms of EAMG, and a lower concentration of anti-AChR antibodies was detected in the serum of Efgartigimod-treated mice. In parallel, a higher content of muscle AChR was found in treated mice. This data demonstrated the effectiveness of an anti-FcRn in ameliorating EAMG. Flow cytometry analysis on splenocytes revealed an increase in CD8+ T cells and a decrease in CD19+B220+ B cells. Interestingly, data revealed a higher percentage of plasma cells (CD138 + TACI +) and long-lived plasma cells (CD138+TACI + CD19-B220-) in Efgartigimod-treated mice compared to PBS-EAMG. Because this increase was not associated with an increase in anti-AChR antibodies, it could be argued that these plasma cells may have a non-pathogenic phenotype with immunoregulatory properties. Expression profiling of miRNA revealed that even if all of them were increased in EAMG mice, only miR-150 was significantly higher. Efgartigimod treatment seemed to restore the expression of miR486 significantly to the HD level. No differences were observed in mRNA expression levels of IRAK and TRAF6 (targets of miR-146a), SMAD2 and PTEN (target of miR-486), and FOXP1 and MYB (targets of miR-150). These findings demonstrate that Efgartigimod not only decreases pathogenic IgG levels but also acts on other immune mechanisms. To better outline the secondary effects of the anti-FcRn administration, additional studies should be conducted to clarify the mechanisms of action of Efgartigimod on B cells differentiation in PC and extend the analysis to more miRNA involved in the immune response. Keywords: Myasthenia Gravis (MG), Autoimmune disorder, Flowcytometry, MicroRNA.
NEUROBIOLOGY [08420]
2024
Neonatal FC receptor blockade in experimental model of Myasthenia Gravis: ex vivo studies to evaluate secondary effects in splenic lymphoid cells.
La miastenia gravis (MG) è una malattia autoimmune, dipendente dai linfociti T e mediata dai linfociti B, caratterizzata da debolezza e affaticamento dei muscoli scheletrici a causa di un malfunzionamento della giunzione neuromuscolare (NMJ). Negli ultimi anni, sono stati proposti numerosi farmaci per il trattamento della MG ed è stato autorizzato l’uso di Efgartigimod, un frammento di anticorpo umano ricombinante IgG1, che si lega al recettore neonatale Fc (FcRn) e blocca il riciclo delle IgG. Di conseguenza, diminuisce il livello di autoanticorpi circolanti, portando a benefici clinici nei pazienti affetti da MG. Poiché il FcRn è espresso non solo sulle cellule endoteliali dei vasi, ma anche sulle cellule immunitarie, lo scopo di questo studio è stato indagare se Efgartigimod potesse avere effetti immunologici, oltre al suo ruolo consolidato nella riduzione delle IgG. La ricerca si è concentrata in particolare sulle cellule linfoidi spleniche in un modello sperimentale di MG (EAMG), integrando approcci cellulari e molecolari. L’EAMG è stato indotto nei topi mediante multiple iniezioni sottocutanee di recettore ACh della Torpedo californica purificato (TAChR), e Efgartigimod o PBS sono stati somministrati per via intraperitoneale due volte a settimana dopo il secondo richiamo. Sono state effettuate valutazioni cliniche per determinare la gravità dei sintomi fino al termine dell’esperimento. Sono state condotte analisi ex vivo per quantificare gli anticorpi anti-AChR circolanti nel siero e il contenuto di AChR muscolare nei topi trattati con Efgartigimod e nei topi EAMG trattati con PBS. La citometria a flusso è stata impiegata per valutare eventuali variazioni nella percentuale di cellule T naive, di memoria effettrice e di memoria centrale (CD4 e CD8). Per la linea cellulare B, sono state selezionate le cellule del centro germinativo, le plasmacellule e le plasmacellule a lunga vita. Inoltre, sono stati isolati alcuni miRNA selezionati (miR-150, miR-146a e miR-486) e i livelli di espressione sono stati confrontati tra il gruppo EAMG, i topi trattati con Efgartigimod e i controlli sani. È stata anche analizzata l’espressione dei bersagli mRNA. I risultati hanno dimostrato l’efficacia di Efgartigimod nel ridurre i sintomi clinici dell’EAMG, e nei topi trattati è stata rilevata una concentrazione più bassa di anticorpi anti-AChR nel siero. Parallelamente, è stato osservato un maggiore contenuto di AChR muscolare nei topi trattati. Questi dati hanno dimostrato l’efficacia dell’anti-FcRn nel migliorare l’EAMG. L’analisi tramite citometria a flusso delle cellule spleniche ha rivelato un aumento delle cellule T CD8+ e una diminuzione delle cellule B CD19+B220+. Interessantemente, i dati hanno mostrato una percentuale più elevata di plasmacellule (CD138+TACI+) e di plasmacellule a lunga vita (CD138+TACI+CD19-B220-) nei topi trattati con Efgartigimod rispetto ai topi EAMG trattati con PBS. Poiché tale aumento non era associato a un aumento degli anticorpi anti-AChR, si può ipotizzare che queste plasmacellule possano avere un fenotipo non patogeno con proprietà immunoregolatorie. Il profilo di espressione dei miRNA ha rivelato che, sebbene tutti fossero aumentati nei topi EAMG, solo il miR-150 mostrava un aumento significativo. Il trattamento con Efgartigimod sembrava ripristinare significativamente l’espressione di miR-486 al livello dei controlli sani. Non sono state osservate differenze nei livelli di espressione dell’mRNA di IRAK e TRAF6 (bersagli del miR-146a), SMAD2 e PTEN (bersagli del miR-486), e FOXP1 e MYB (bersagli del miR-150).
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/20.500.14239/29524