Simulazioni di Dinamica Molecolare per modellare gli effetti allosterici indotti dalla fosforilazione di due serine in Hsp90β

In this thesis, I will present the results of computational chemistry studies carried out in these months. Classical Molecular Dynamics (MD) simulations were used to study the allosteric effects induced by the phosphorylation of two serines in each protomer of the Hsp90β homodimer. Hsp90β and its α isoform belong to the HSP family, whose main function is to act as molecular chaperones. In particular, Hsp90β is involved in numerous biological processes, including protein folding and activation and the stress response. It plays a role in fundamental processes such as cell proliferation and, when altered by specific post translational modifications, also in carcinogenesis. On this topic, for example, experimental studies indicate that the phosphorylation of two serines (226–255) on each protomer of Hsp90β promotes the onset of certain carcinomas, and it has been hypothesised that this is due to an increased ability to interact with co chaperones and client proteins. The main objective of this thesis is to investigate by MD any alterations induced by the phosphorylation of Ser266 and Ser255, recognizing any differences between the semi closed, closed and client-bound conformations in the wild type and the phosphorylated form, and then determining how these structural differences might modify the protein’s function in the ATPase cycle and in complex with the co chaperone Cdc37 and the client CDK4. The MD simulations were carried out and analysed using the AMBER suite. The main analyses focus on local interactions caused by phosphorylation, fluctuations, allosteric effects through Distance Fluctuations and Principal Component Analysis (PCA). The analyses indicate that phosphorylation induces specific conformational changes: in particular, the formation of hydrogen bonds helps to stabilise the Hsp90β conformation in complex with Cdc37 and CDK4 compared to the wild type. Moreover, all subsequent analyses confirm this trend, reinforcing the hypothesis that phosphorylation promotes extensive stabilisation of these complexes, with effects observed in domains not strictly vicinal to the loop containing the serines. These studies also revealed different behaviours between the two protomers of Hsp90β. This work highlights the role of phosphorylation and the changes it produces in regulating Hsp90β function. Since phosphorylated Hsp90β is involved in diseases such as various types of tumours and neurodegenerative disorders by promoting the stabilisation of its epichaperomic form, the increased interactions induced by phosphorylation could represent a target for the development of potential therapeutic strategies.

In questo progetto di tesi, esporrò i risultati degli studi di chimica computazionale compiuti in questi mesi. Sono state utilizzate simulazioni di dinamica molecolare classica (MD) per studiare gli effetti allosterici indotti dalla fosforilazione di due serine in ciascun protomero dell’omodimero Hsp90β. Hsp90β e la sua isoforma α rientrano nella famiglia delle HSP la cui funzione principale è quella di essere dei chaperone molecolari. In particolare, Hsp90β è implicata in numerosi processi biologici, inclusi il ripiegamento e l’attivazione delle proteine e la risposta allo stress. È coinvolta in processi fondamentali come la proliferazione cellulare e, quando alterata da specifiche modifiche post traduzionali, anche nella carcinogenesi. Su questo tema, ad esempio, studi sperimentali indicano che la fosforilazione di due serine (226-255) su ciascun protomero di Hsp90β favoriscono l’insorgere di taluni carcinomi, e si è ipotizzato che ciò sia dovuto ad un’aumentata capacità di interagire con cochaperone e proteine client. L’obiettivo principale della tesi è quello di approfondire mediante MD eventuali alterazioni indotte dalla fosforilazione di Ser226 e Ser255, riconoscendo eventuali differenze tra le conformazioni semi chiusa, chiusa, e con il client tra la forma wild type e quella fosforilata, ed individuando poi come queste differenze strutturali possano andare a modificare il funzionamento della proteina nel ciclo ATP-asico e nel complesso con il cochaperone Cdc37 e il client CDK4. Le MD sono state eseguite ed analizzate con la suite AMBER. Le analisi principali riguardano le interazioni locali che la fosforilazione provoca, le fluttuazioni, gli effetti allosterici tramite le Distance Fluctuations, e l’analisi delle componenti principali (PCA). Le analisi indicano che la fosforilazione provoca cambiamenti conformazionali specifici: in particolare, la formazione di legami a idrogeno contribuisce a mantenere più stabile la conformazione di Hsp90β in complesso con Cdc37 e CDK4, rispetto alla forma wild type. Inoltre, tutte le successive analisi confermano questa tendenza, rafforzando l’ipotesi che la fosforilazione favorisca un’ampia stabilizzazione di questi complessi, con effetti anche su domini non strettamente adiacenti al loop che contiene le serine. Gli studi hanno rivelato anche comportamenti diversi tra i due protomeri di Hsp90β. Il lavoro mette in evidenza il ruolo della fosforilazione e i cambiamenti che questa produce sulla regolazione della funzione di Hsp90β. Poiché Hsp90β fosforilata è appunto coinvolta in malattie come diversi tipi di tumori e in patologie neurodegenerative favorendo la stabilizzazione della sua forma epichaperomica, le aumentate interazioni indotte dalla fosforilazione possono essere un bersaglio per lo sviluppo di potenziali strategie terapeutiche.