Rimodellamento stress-indotto dei corpi nucleari via PEF1

Calcium (Ca2+) is a prototypical second messenger and a potent effector of cellular stress. Indeed, Ca2+ orchestrates a vast array of adaptive responses through complex spatiotemporal signaling patterns. Despite significant research efforts, the precise mechanisms underlying the coupling of Ca2+ signals to specific cellular responses, notably the functional integration of the nucleus, are incompletely understood. In recent years, the role of membrane-less organelles (MLOs) or condensates in mediating rapid, adaptive nuclear responses to stress has become increasingly clear. These structures are established through a process that rapidly concentrates and/or sequesters specific proteins and nucleic acids to organize dynamic compartments that can aid specific biochemical reactions. The ability of a protein to participate in the formation of MLOs can be predicted thanks to the presence of intrinsically disordered regions (IDRs), which confer the necessary structural flexibility. On the other hand, very little is known on whether and how cellular signalling events may participate in the formation and dynamics of MLOs. Interestingly, some initial experimental evidence suggests that Ca2+ may drive the formation of cytoplasmic MLOs. However, the molecular targets as well as the triggering conditions through which Ca2+ regulates nuclear condensates remain largely unexplored. In this thesis, we investigated the stress-induced response of Pef1, a member of the penta-EF-hand (PEF) protein family that possesses Ca2+-sensing domains and is condensation-prone thanks to a N-terminal IDR. We designed an experimental workflow aiming to follow the behaviour of PEF1 in response to Ca2+-mobilizing agonists as well as drugs that induce specific nuclear stresses. We used antibody screenings for the detection of endogenous PEF1 and were able to map its subcellular distribution in relation to known nuclear bodies (PML bodies, paraspeckles and nuclear speckles) under normal or stress conditions. While we used fluorescently tagged PEF1 for live-cell imaging FRAP-based experiments to confirm the dynamic nature of PEF1-based nuclear condensates. Our study identifies Pef1 as a driver of the dynamic responses of nuclear condensates to cellular stress, and provides the first evidence of a molecular link between nuclear stress adaptive nuclear compartmentalization through MLOs and Ca2+ signals.

Il calcio (Ca²⁺) è un secondo messaggero prototipico e un potente effettore dello stress cellulare. Coordina un'ampia gamma di risposte adattative attraverso complessi pattern di segnalazione spazio-temporali. Nonostante gli sforzi significativi della ricerca, i meccanismi precisi che collegano i segnali di Ca²⁺ a specifiche risposte cellulari, in particolare all’integrazione funzionale del nucleo, rimangono ancora in gran parte non chiariti. Negli ultimi anni, il ruolo degli organelli senza membrana (MLOs) o condensati biomolecolari nella mediazione di risposte nucleari rapide e adattative allo stress è diventato sempre più evidente. Queste strutture si formano attraverso processi che concentrano o sequestrano rapidamente proteine e acidi nucleici specifici, organizzando compartimenti dinamici in grado di facilitare reazioni biochimiche selettive. La capacità di una proteina di partecipare alla formazione di MLOs può essere predetta dalla presenza di regioni intrinsecamente disordinate (IDRs), che conferiscono la necessaria flessibilità strutturale. Tuttavia, è ancora poco noto se e come eventi di segnalazione cellulare, come quelli mediati dal Ca²⁺, possano influenzare la formazione e la dinamica di tali condensati. Dati sperimentali preliminari suggeriscono che il Ca²⁺ possa promuovere la formazione di MLOs citoplasmatici, ma i bersagli molecolari e le condizioni di attivazione attraverso cui il Ca²⁺ regola i condensati nucleari restano in gran parte inesplorati. In questa tesi abbiamo studiato la risposta indotta da stress di Pef1, un membro della famiglia di proteine penta-EF-hand (PEF) che possiede domini sensibili al Ca²⁺ e una regione N-terminale intrinsecamente disordinata, che la rende suscettibile alla condensazione. Abbiamo sviluppato un protocollo sperimentale mirato ad analizzare il comportamento di Pef1 in risposta ad agonisti che mobilitano il Ca²⁺ e a farmaci in grado di indurre specifiche condizioni di stress nucleare. Attraverso screening anticorpali, abbiamo rilevato la distribuzione subcellulare di Pef1 endogena e la sua localizzazione rispetto a noti organelli nucleari, come i corpi PML, i paraspeckles e gli speckles nucleari, in condizioni basali e di stress. Inoltre, mediante esperimenti di live-cell imaging e FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) su Pef1 marcato fluorescentemente, abbiamo confermato la natura dinamica dei condensati nucleari associati a questa proteina. Il nostro studio identifica Pef1 come un regolatore chiave della risposta dinamica dei condensati nucleari allo stress cellulare, e fornisce la prima evidenza molecolare di un collegamento tra i segnali di Ca²⁺ e la compartimentazione nucleare adattativa mediata dalla formazione di MLOs.