Tracciamento Genome-wide della DNA Polimerasi η in assenza e presenza di danno UV

Eukaryotic cells are continuously exposed to genotoxic insults that can impede faithful DNA replication and threaten genome stability. To ensure replication completion, cells employ DNA damage tolerance mechanisms, including translesion synthesis (TLS), to overcome replication barriers. DNA polymerase η (Pol η) facilitates error-free bypass of UV-induced cyclobutane pyrimidine dimers and is also involved in replicating challenging, but undamaged, genomic regions. Recent evidence has expanded Pol η's functional repertoire beyond canonical damage bypass, yet comprehensive understanding of Pol η dynamics across the genome remains limited, with previous studies constrained to individual loci or reliant on catalytically inactive variants of the polymerase. This thesis established an optimized ChIP-seq approach for tracking the intrinsically dynamic polymerase η in cells synchronized in early, middle, and late S-phase under both unchallenged and UV-irradiated conditions. This strategy enabled definition of high-confidence occupancy profiles and temporal recruitment patterns. Genome-wide analysis revealed consistent enrichment at promoter regions, with peak localization concentrated within 1kb of transcription start sites and a characteristic bimodal signal distribution flanking rather than centered on TSSs. While no specific recruitment to telomeric regions was observed in our ALT-negative cell line, approximately 5% of Pol η peaks localized to high-confidence G-quadruplex structures. At G4s, Pol η exhibited a distinctive bimodal pattern with signal enrichment flanking G4s, suggesting preferential association with adjacent sequences rather than stable G4 cores, consistent with a role in resolving replication or transcriptional impediments. Notably, 36-38% of Pol η peaks mapped to annotated fragile sites across all experimental conditions, indicating constitutive rather than damage-induced recruitment, while individual fragile sites displayed distinct temporal patterns. Integration with replication initiation zone data demonstrated that the orderly pattern of Pol η distribution observed in unchallenged cells becomes substantially altered following UV exposure. This study provides a methodological framework for investigating dynamic TLS polymerases and establishes principles governing Pol η chromatin engagement under physiological and genotoxic conditions, expanding our understanding of how specialized polymerases interface with both endogenous replication challenges and exogenous damage response.

Le cellule eucariotiche sono costantemente esposte ad insulti genotossici che possono ostacolare la fedele replicazione del DNA e minacciare la stabilità genomica. Per garantire il completamento della replicazione, le cellule impiegano meccanismi di tolleranza al danno del DNA, tra cui la sintesi translesione (TLS), per superare le barriere replicative. La DNA polimerasi η (Pol η) facilita il bypass privo di errori dei dimeri di pirimidina ciclobutano indotti da UV ed è inoltre coinvolta nella replicazione di regioni genomiche critiche, anche in assenza di danni. Evidenze recenti hanno ampliato il repertorio funzionale di Pol η oltre il canonico bypass del danno; tuttavia, la comprensione esaustiva delle dinamiche di Pol η attraverso il genoma rimane limitata, con studi precedenti circoscritti a singoli loci o basati su varianti cataliticamente inattive della polimerasi. Questa tesi ha stabilito un approccio ChIP-seq ottimizzato per monitorare la DNA polimerasi η, intrinsecamente dinamica, in cellule sincronizzate nelle fasi precoce, intermedia e tardiva della fase S, sia in condizioni basali che in seguito ad irradiazione UV. Tale strategia ha permesso di definire profili di occupazione ad alta confidenza e pattern temporali di reclutamento. L’analisi genome-wide ha rivelato un consistente arricchimento nelle regioni promotrici, con localizzazione dei picchi concentrata entro 1kb dai siti d’inizio della trascrizione e una caratteristica distribuzione bimodale del segnale che fiancheggia, piuttosto che centrarsi, sui TSS. Mentre non è stato osservato alcun reclutamento specifico nelle regioni telomeriche nella nostra linea cellulare ALT-negativa, circa il 5% dei picchi di Pol η si localizza in corrispondenza di strutture a quartetti G ad alta confidenza. In corrispondenza dei G4, Pol η ha mostrato un distintivo pattern bimodale con arricchimento del segnale ai lati delle strutture G4, suggerendo un’associazione preferenziale con le sequenze adiacenti piuttosto che con i nuclei stabili dei G4, coerentemente con un ruolo nella risoluzione di impedimenti replicativi o trascrizionali. È significativo che il 36-38% dei picchi di Pol η si localizzi in siti fragili annotati in tutte le condizioni sperimentali, indicando un reclutamento costitutivo piuttosto che indotto dal danno, mentre singoli siti fragili hanno mostrato pattern temporali distinti. L’integrazione con i dati delle zone di iniziazione della replicazione ha dimostrato che il pattern ordinato di distribuzione di Pol η osservato in cellule non trattate risulta sostanzialmente alterato in seguito all’esposizione UV. Questo studio fornisce un quadro metodologico per l’investigazione delle polimerasi TLS dinamiche e stabilisce i principi che governano l’integrazione di Pol η con la cromatina in condizioni fisiologiche e genotossiche, ampliando la nostra comprensione di come le polimerasi specializzate interagiscono sia con le sfide replicative endogene che con la risposta al danno esogeno.