Sviluppo e caratterizzazione di anticorpi bispecifici per la Leucemia Mieloide Acuta

Acute myeloid leukaemia (AML) is the third most common leukaemia worldwide and represents a disease with poor prognosis, with a 5-year survival of around 30%. Despite achieving complete remission after chemotherapy and/or hematopoietic stem cell transplantation (HSCT), a significant fraction of patients relapses within three years. Relapse is thought to be driven by residual leukemic stem cells (LSCs), which are not efficiently eradicated by current therapies. In addition, standard treatments are associated with severe on-target off-tumour toxicities affecting the healthy hematopoietic system. The development of novel therapeutic approaches able to selectively eliminate LSCs and blasts while sparing healthy hematopoietic stem cells (HSCs) is therefore of major clinical interest. Three main challenges hinder the selective targeting of LSCs: i) the heterogeneity of AML; ii) the lack of LSC-specific antigens, and iii) the overlap in antigen expression between LSCs and HSCs. In this thesis, we aimed at engineering bispecific antibodies with improved selectivity against LSCs and blasts. Two well-established AML surface markers were selected (referred to as antigen A and antigen B) based on the fact that, while not being LSC-specific on their own, they are often simultaneously expressed on LSCs and blasts. Two different bispecific antibodies against antigens A and B were generated. Among the two formats explored, the bispecific antibody FcKIH-(scFv)2, featuring an Fc with knobs-into-holes mutations fused to two scFvs, was produced with higher yields and stability and was therefore selected as a candidate for binding experiments. The bispecific antibody showed a preferential binding to CHO cells engineered to express antigens A+B over single antigen-positive CHO cells, achieving higher receptor engagement. Consistent results were obtained on an AML cell line, where the bispecific antibody showed higher affinity towards double antigen-positive cells. Taken together, these results demonstrate that the bispecific antibody in FcKIH-(scFv)2 format could be produced with good purity and displayed preferential binding towards double antigen-positive cells. The results represent a promising proof-of-concept for the rational development of novel bispecific antibodies with improved selectivity and safety, aimed at reducing AML relapse by eradicating LSCs and blasts and sparing healthy HSCs.

La leucemia mieloide acuta (AML) è la terza forma di leucemia più comune a livello mondiale e rappresenta una patologia a prognosi sfavorevole, con una sopravvivenza a 5 anni di circa il 30%. Nonostante il raggiungimento della remissione completa dopo chemioterapia e/o trapianto di cellule staminali ematopoietiche (HSCT), una quota significativa di pazienti va incontro a recidiva entro tre anni. Si ritiene che le recidive siano guidate dalle cellule staminali leucemiche residue (LSC), che non vengono efficacemente eradicate dalle terapie attuali. Inoltre, i trattamenti standard sono associati a gravi tossicità “on-target off-tumour”, che colpiscono il sistema ematopoietico sano. Lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici in grado di eliminare selettivamente LSC e blasti, risparmiando le cellule staminali ematopoietiche sane (HSC), rappresenta quindi un obiettivo di grande rilevanza clinica. Tre principali sfide ostacolano il targeting selettivo delle LSC: i) l’eterogeneità dell’AML; ii) l’assenza di antigeni specifici per le LSC; iii) la sovrapposizione nell’espressione degli antigeni tra LSC e HSC. In questa tesi, ci siamo posti l’obiettivo di ingegnerizzare anticorpi bispecifici con una selettività migliorata verso LSC e blasti. Sono stati scelti due marcatori di superficie ben caratterizzati dell’AML (indicati come antigene A e antigene B) sulla base del fatto che, pur non essendo specifici delle LSC singolarmente, vengono spesso espressi contemporaneamente su LSC e blasti. Sono stati generati due diversi anticorpi bispecifici diretti contro gli antigeni A e B. Tra i due formati esplorati, l’anticorpo bispecifico FcKIH-(scFv)2, caratterizzato da una regione Fc con mutazioni “knobs-into-holes” fusa a due scFv, è stato prodotto con rese e stabilità maggiori ed è stato quindi selezionato come candidato per gli esperimenti di binding. L’anticorpo bispecifico ha mostrato un legame preferenziale con cellule CHO ingegnerizzate per esprimere entrambi gli antigeni A+B rispetto a cellule CHO positive per un singolo antigene, ottenendo un maggiore coinvolgimento recettoriale. Risultati coerenti sono stati ottenuti su una linea cellulare di AML, dove l’anticorpo bispecifico ha mostrato una maggiore affinità verso cellule positive a doppio antigene. Nel complesso, questi risultati dimostrano che l’anticorpo bispecifico nel formato FcKIH-(scFv)2 può essere prodotto con buona purezza e presenta un legame preferenziale verso cellule doppio-antigene positive. I risultati rappresentano una promettente prova di concetto per lo sviluppo razionale di nuovi anticorpi bispecifici con selettività e sicurezza migliorate, mirati a ridurre le recidive di AML attraverso l’eradicazione di LSC e blasti, risparmiando al contempo le HSC sane.