Caratterizzazione del ruolo di NCX nella migrazione delle cellule di GBM e del suo coinvolgimento nella formazione del mimetismo vascolare tumorale

Glioblastoma (GBM), classified by the World Health Organization (WHO) as a grade IV glioma, is the most aggressive and lethal brain tumor. Despite the standard therapeutic approach combining surgery, radiotherapy, and chemotherapy with Temozolomide (TMZ), the prognosis is poor, with an average survival limited to 14-16 months. This clinical failure is due to the extreme heterogeneity of the tumor and its intrinsic resistance to therapy, a phenomenon accentuated by the presence of tumor stem cells (GBCSCs) and particularly marked in the mesenchymal (MES) subtype. Resistance to therapies is further fueled by specific molecular mechanisms and the complexity of the tumor microenvironment, which induces immunosuppression. In this scenario, ion channels and transporters have emerged as key regulators of malignant processes, and the Na+/Ca2+ transporter (NCX), crucial for intracellular calcium homeostasis, has previously been associated with GBM invasiveness in immortalized cells (U251). The primary objective of this work was to extend and deepen this knowledge, focusing the investigation on the functional role of NCX in a more aggressive and relevant clinical model. To this end, the primary cell line of mesenchymal subtype GBM (GBM19) was analyzed, an in vitro model that more closely reflects the biological complexity in vivo than immortalized lines. The research specifically aimed to clarify the role of NCX during cell migration and to explore the involvement of the transporter in the spontaneous formation of Vasculogenic Mimicry (VM) structures. Several experimental approaches were used: a tumor migration model was created in GBM19 using the wound healing assay, and morphological and phenotypic analysis was used to characterize the formation of loops and the related expression of the VE-cadherin marker; whole-cell electrophysiology confirmed the functional activity of NCX in migrating cells; the migration assay combined with time-lapse microscopy allowed the impact of the selective inhibitor bepridil (6.25 μM) on wound closure and loop dynamics to be evaluated. Finally, a correlation analysis related the amplitude of the NCX current to the length of the cell extensions. The results confirm significant biological and functional activity of NCX in this primary model of mesenchymal GBM, known to be the most aggressive and invasive subtype. This work provides new insights into the electrophysiological and morphological heterogeneity of mesenchymal GBM, laying the foundation for future investigations aimed at clarifying the molecular mechanisms through which NCX modulates invasion and VM structure formation.

Il Glioblastoma (GBM), classificato dall'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) come glioma di grado IV, è la neoplasia cerebrale più aggressiva e letale. Nonostante l'approccio terapeutico standard che combina chirurgia, radioterapia e chemioterapia con Temozolomide (TMZ), la prognosi è infausta, con una sopravvivenza media limitata a 14-16 mesi. Questo fallimento clinico è dovuto all'estrema eterogeneità del tumore e alla sua intrinseca resistenza alla terapia, fenomeno accentuato dalla presenza di cellule staminali tumorali (GBCSCs) e particolarmente marcato nel sottotipo Mesenchimale (MES). La resistenza alle terapie è ulteriormente alimentata da meccanismi molecolari specifici e dalla complessità del microambiente tumorale, che induce l'immunosoppressione. In questo scenario, i canali ionici e i trasportatori sono emersi come regolatori chiave dei processi maligni, e il trasportatore Na+/Ca2+ (NCX), cruciale per l'omeostasi del calcio intracellulare, è stato precedentemente associato all'invasività del GBM in cellule immortalizzate (U251). L'obiettivo primario di questo lavoro è stato quello di estendere e approfondire tale conoscenza, focalizzando l'indagine sul ruolo funzionale dell'NCX in un modello clinico più aggressivo e rilevante. A tale scopo, è stata analizzata la linea cellulare primaria di GBM di sottotipo mesenchimale (GBM19), un modello in vitro che rispecchia più fedelmente la complessità biologica in vivo rispetto alle linee immortalizzate. La ricerca ha mirato specificatamente a chiarire la il ruolo di NCX durante la migrazione cellulare e a esplorare il coinvolgimento del trasportatore nella spontanea formazione di strutture di Mimetismo Vasculogenico (VM). Sono stati impiegati diversi approcci sperimentali: con il wound healing assay è stato creato un modello di migrazione tumorale in GBM19, e con l'analisi morfologica e fenotipica è stata caratterizzata la formazione di strutture ad anello (loops) e la correlata espressione del marcatore VE-Caderina; con l'elettrofisiologia in configurazione whole-cell è stata confermata l'attività funzionale dell'NCX nelle cellule migranti; il saggio di migrazione abbinato alla microscopia time-lapse, ha permesso di valutare l'impatto dell'inibitore selettivo bepridil (6.25 μM) sulla chiusura della ferita e sulla dinamica dei loops. Infine, un'analisi di correlazione ha messo in relazione l'ampiezza della corrente NCX con la lunghezza delle estensioni cellulari. I risultati ottenuti confermano una significativa attività biologica e funzionale dell'NCX in questo modello primario di GBM mesenchimale, notoriamente il sottotipo più aggressivo e invasivo. Questo lavoro fornisce nuove intuizioni sull'eterogeneità elettrofisiologica e morfologica del GBM mesenchimale, ponendo le basi per future indagini volte a chiarire i meccanismi molecolari attraverso i quali l'NCX modula l'invasione e la formazione di strutture VM.