Cellule Progenitrici Neurali Derivate da Paziente: un Modello Robusto per Indagare e Definire la Disfunzione Ciliare e la Segnalazione Shh nella Sindrome di Joubert

Ciliopathies are a class of heterogeneous multisystemic congenital disorders, resulting from structural or functional defects in cilia, microtubule-based organelles present on almost all vertebrate cells. Dysfunction of non-motile cilia, key sensors of extracellular changes, underlies primary ciliopathies like Joubert Syndrome (JS). Over 45 causative genes have been associated with the syndrome, of whom four of them (CPLANE1, RPGRIP1L, CC2D2A and TMEM67) can explain 70% of positive cases. The aim of this thesis is to investigate how alterations in four main JS genes affect Shh pathway activity and primary cilium architecture in patient-derived Neural Progenitor Cells (smNPCs) differentiated from induced Pluripotent Stem Cells, with the final goal of uncovering potential genotype-phenotype correlations.. I firstly evaluated variants’ effect on splicing and the potential activation of nonsense-mediated mRNA decay. Then, I proceed by performing quantitative and qualitative assessment of primary cilium, followed by real-time quantitative PCR (qPCR) to measure Shh signaling pathway alteration. Interestingly, most patient-derived smNPCs exhibited a significantly reduced proportion of ciliated cells (20–60%) compared to controls (~80%), together with gene dependent alteration of cilium average length. Complementary qPCR analysis of Shh pathway based on GLI1 and PTCH1 expression, revealed different responses across patient lines, with clear upregulation across CPLANE1 and TMEM67 patients, and downregulation across RPGRIP1L patients, whereas CC2D2A patients presented some discrepancies. To confirm the obtained data creation of KO-iPS cell lines are on-going: TMEM67-KO cell line was correctly created, while those of CC2D2A and RPGRIP1L were actually heterozygous, needing a second round of nucleofetion. CPLANE1 cell line still to be obtained. Finally, to explore whether differences in the results could arise from other cilia-dependent pathways, future studies will assess Wnt pathway activation, given its interplay with Shh and dependence on primary cilia. By correlating gene-specific alterations in ciliary structure and Shh pathway signaling, this work advances the understanding of the molecular heterogeneity underlying JS and highlight distinct genotype-dependent effects. Although some signaling responses were unexpected and remain unexplained, these findings evidence the complexity of genotype–phenotype relationships in JS and provide a foundation for further investigation into the molecular mechanisms driving clinical variability.

Le ciliopatie sono una classe di disordini congeniti eterogenei e multisistemici, derivanti da difetti strutturali o funzionali delle cilia, organelli basati sui microtubuli presenti in quasi tutte le cellule dei vertebrati. La disfunzione delle cilia non motili, sensori fondamentali dei cambiamenti extracellulari, è alla base delle ciliopatie primarie come la Sindrome di Joubert (JS). Sono stati associati alla sindrome oltre 45 geni causativi, di cui quattro (CPLANE1, RPGRIP1L, CC2D2A e TMEM67) possono spiegare il 70% dei casi positivi. Lo scopo di questa tesi è indagare come le alterazioni in quattro geni principali della JS influenzino l’attività della via di segnalazione Shh e l’architettura del cilio primario in cellule progenitrici neurali derivate da paziente (smNPCs), differenziate da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs), con l’obiettivo finale di individuare potenziali correlazioni genotipo-fenotipo. In primo luogo, ho valutato l’effetto delle varianti sullo splicing e la potenziale attivazione del decadimento mediato da nonsense (NMD). Successivamente, ho eseguito una valutazione quantitativa e qualitativa del cilio primario, seguita da PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) per misurare le alterazioni nella via di segnalazione Shh. È interessante osservare che la maggior parte delle smNPCs derivate da paziente ha mostrato una proporzione significativamente ridotta di cellule ciliate (20–60%) rispetto ai controlli (~80%), insieme ad alterazioni della lunghezza media del cilio dipendenti dal gene. Analisi qPCR complementari della via di segnalazione Shh, basate sull’espressione di GLI1 e PTCH1, hanno rivelato risposte differenti tra le linee cellulari dei pazienti, con una chiara hyper-regolazione nei pazienti CPLANE1 e TMEM67, e una hypo-regolazione nei pazienti RPGRIP1L, mentre i pazienti CC2D2A hanno mostrato alcune discrepanze. Per confermare i dati ottenuti, è in corso la creazione di linee cellulari iPS knockout (KO): la linea TMEM67-KO è stata correttamente generata, mentre quelle di CC2D2A e RPGRIP1L risultano attualmente eterozigoti, richiedendo un secondo ciclo di nucleofezione. La linea cellulare CPLANE1 deve ancora essere ottenuta. Infine, per esplorare se le differenze nei risultati possano derivare da altre vie dipendenti dalle cilia, studi futuri valuteranno l’attivazione della via Wnt, dato il suo intreccio con Shh e la dipendenza dal cilio primario. Correlando le alterazioni gene-specifiche nella struttura ciliare e nella segnalazione della via Shh, questo lavoro contribuisce ad approfondire la comprensione dell’eterogeneità molecolare alla base della JS ed evidenzia effetti distinti dipendenti dal genotipo. Sebbene alcune risposte di segnalazione siano state inattese e restino al momento senza spiegazione, questi risultati testimoniano la complessità delle relazioni genotipo–fenotipo nella JS e forniscono una base per ulteriori indagini sui meccanismi molecolari che determinano la variabilità clinica.