Co-registrazione di immagini tomografiche e confocali per la ricostruzione morfo-funzionale dell'ovario murino prepuberale

L’ovario è un organo estremamente dinamico ed è la sede in cui, ciclicamente, avvengono i processi di follicologenesi e di oogenesi, insieme alla sintesi di ormoni coinvolti nella regolazione del ciclo riproduttivo. Nell’ovario murino, la follicologenesi è divisa in otto stadi, dal primordiale T1 all’antrale preovulatorio T8. Durante questo processo, solo pochi follicoli giungono al termine della crescita, ovulando un oocita maturo, mentre la maggior parte va incontro ad atresia, un meccanismo fisiologico di morte programmata. A partire dal compartimento antrale, inoltre, è possibile osservare due popolazioni di oociti, che sono contraddistinte da due diverse organizzazioni cromatiniche: SN, surrounded nucleolus, e NSN, not-surrounded nucleolus. Studi precedenti dimostrano come gli oociti antrali SN mostrino competenza allo sviluppo embrionale pre-impianto, mentre gli oociti antrali NSN, anche se fecondati, arrestano il proprio sviluppo allo stadio di due cellule. Nonostante si conosca, almeno in parte, l’importanza che la comunicazione bidirezionale che si instaura tra il follicolo e l’oocita durante la maturazione ha per l’acquisizione della competenza allo sviluppo, ancora inesplorato rimane il ruolo che il microambiente ovarico tridimensionale circostante abbia in questo processo. La complessità strutturale e funzionale dell’ovario, unita al costante rimodellamento del suo tessuto, ha reso fondamentale lo sviluppo di tecniche che ne permettano un’analisi tridimensionale. In questo contesto si sviluppa il mio progetto di tesi, che ha l’obiettivo di associare un’analisi funzionale dell’ovario effettuata al microscopio confocale all’analisi morfologico-strutturale eseguita utilizzando la nano-tomografia computerizzata (nanoCT), per osservare la distribuzione dei diversi follicoli e degli oociti competenti allo sviluppo direttamente nel volume ovarico 3D. La procedura, messa a punto nel Laboratorio di Biologia e Biotecnologie della Riproduzione, ha previsto inizialmente l’imaging tramite nanoCT di 3 ovari di topo di 25 giorni per identificare e classificare tutti i follicoli presenti nel volume ovarico in base alla tipologia (dal T3 al T8) e al loro stato funzionale (sano o atresico). Successivamente, l’ovario è stato tagliato in sezioni di 20 μm che sono state marcate con il colorante fluorescente DAPI e acquisite al microscopio confocale. Su queste è stato possibile classificare le due tipologie di oociti, SN o NSN, in base alla loro conformazione cromatinica. Successivamente abbiamo co-registrato le immagini confocali e tomografiche, per aggiungere ai follicoli taggati nel dataset tomografico le informazioni sulla conformazione della cromatina degli oociti contenuti. Questi dati hanno mostrato una distribuzione simmetrica nel volume ovarico sia delle tipologie follicolari, sia sane che atresiche, che degli oociti SN o NSN contenuti al loro interno. È, inoltre, interessante notare come l’atresia sia assente nei follicoli primari T3 e che colpisca maggiormente i follicoli dallo stadio preantrale T5. Gli oociti NSN sono stati associati principalmente a follicoli sani in crescita, mentre la conformazione SN è stata associata a follicoli atresici T5 e T6 (preantrali e antrali precoci) ed è l’unica rilevata nei follicoli T8 preovulatori sani. In conclusione, questa procedura rappresenta un primo tentativo di classificazione e localizzazione delle diverse tipologie follicolari considerandone lo stato di atresia e la competenza allo sviluppo degli oociti nell’intero volume ovarico 3D. Questa pipeline potrà essere impiegata per lo studio dei cambiamenti nell’organizzazione 3D dei processi di follicologenesi e oogenesi durante l’invecchiamento ovarico, o in condizioni patologiche associate a infertilità, come l’insufficienza ovarica prematura (POI) o la sindrome dell’ovario policistico (PCOS).