Studio dei meccanismi molecolari che contribuiscono alle risposte dell’interferone di tipo I nella Sindrome di Aicardi-Goutières.

Aicardi-Goutières syndrome (AGS) is a rare genetic neuroinflammatory disorder caused by mutations in genes involved in nucleic acid metabolism, including the cytosolic exonuclease TREX1. This condition causes the abnormal accumulation of DNA and RNA in the cytoplasm, which persistently activates innate immune pathways and results in chronic overproduction of type I interferons. In our study we firstly characterized a TREX1 knockout (KO) cell model generated in the U2OS osteosarcoma line previously in our laboratory via transient CRISPR/Cas9 delivery and single clone selection. This model shows a spontaneous accumulation of DNA damage, elevated levels of Interferon Stimulated Genes (ISGs), and heightened inflammatory activation, all hallmarks of AGS. We have shown that TREX1 deficiency also compromises mitochondrial integrity, with the release of mtDNA and mtRNA into the cytosol, contributing to the activation of innate immune responses. Notably, pharmacological depletion of mtDNA and inhibition of mitochondrial RNA transcription revealed a predominant role of mitochondrial RNA in modulating the antiviral response, highlighting that an RNA-mediated mechanism could contributing to chronic inflammation in AGS. Secondly, we aimed to generate an SH-SY5Y neuronal cell line-based TREX1 KO model, as more representative of the disease phenotype as these cells derive from nervous tissue and are competent for the cGAS-STING pathway. However, neither the single clone gene knockout nor the transient silencing through siRNAs proved effective in the SH-SY5Y cell model due to counterselection of KO cells or suboptimal efficacy of depletion, we decided to adopt a more stable and durable approach, namely the generation of a SH-SY5Y TREX1 depleted cell line by CRISPR/Cas9-mediated genome editing provided with an lentiviral vector. For this reason, we developed a stable model using an LV.V2 lentiviral vector for concomitant and constitutive Cas9 and gRNA expression that has demonstrated efficacy in the U2OS cells and promises similar results in SH-SY5Y, paving the way for more in-depth functional studies in the neurobiological context. In conclusion, the loss of function of TREX1 alters the management of both nuclear and mitochondrial intracellular nucleic acids, causing abnormal activation of innate immune responses and chronic inflammation typical of AGS. The correlation between mitochondrial dysfunction and interferon signalling offers new therapeutic perspectives, suggesting the potential of approaches aimed at modulating mitochondrial stress and immune pathways, in addition to current strategies focused on removing nucleic acids or inhibiting the inflammatory response.

La sindrome di Aicardi-Goutières (AGS) è una rara malattia genetica neuroinfiammatoria causata da mutazioni in geni coinvolti nel metabolismo degli acidi nucleici, incluso TREX1. Questa condizione determina un accumulo anomalo di DNA e RNA nel citoplasma, che attiva persistentemente le vie immunitarie innate e provoca una produzione cronica eccessiva di interferone di tipo I. Nel nostro studio abbiamo caratterizzato il modello cellulare knockout (KO) di TREX1 nella linea U2OS, precedentemente creato nel nostro laboratorio tramite CRISPR/Cas9 e validato a livello genetico e proteico. Questo modello mostra un accumulo spontaneo di danni al DNA, alti livelli di geni stimolati dall’interferone e un’attivazione infiammatoria accentuata, tutti segni distintivi della AGS. Abbiamo dimostrato che la carenza di TREX1 compromette anche l’integrità mitocondriale, con il rilascio di mtDNA e mtRNA nel citosol che contribuisce all’attivazione delle risposte immunitarie innate. In particolare, la deplezione farmacologica del mtDNA e l’inibizione della trascrizione dell’RNA mitocondriale hanno evidenziato un ruolo predominante dell’RNA mitocondriale nella modulazione della risposta antivirale, suggerendo un meccanismo mediato dall’RNA che potrebbe contribuire all’infiammazione cronica nella AGS. In questo lavoro abbiamo tentato di generare un modello TREX1 KO nella linea SH-SY5Y, più rappresentativa del fenotipo della malattia, derivata da tessuto nervoso e competente per la via cGAS-STING. Poiché né il precedente knockout genico né il silenziamento transitorio mediante siRNA si sono dimostrati efficaci nel modello cellulare utilizzato, abbiamo scelto un approccio più stabile e duraturo, ovvero la generazione di una linea cellulare SH-SY5Y depleta di TREX1 tramite editing genico mediato da CRISPR/Cas9 supportato da un vettore lentivirale LV.V2. Abbiamo quindi sviluppato un modello stabile utilizzando il vettore lentivirale LV.V2 per l’espressione di Cas9 e gRNA, che ha dimostrato efficacia in U2OS e promette risultati analoghi in SH-SY5Y, aprendo la strada a studi funzionali più approfonditi in un contesto neurobiologico. In conclusione, la perdita di funzione di TREX1 altera la gestione degli acidi nucleici intracellulari nucleari e mitocondriali, causando un’attivazione anomala delle risposte immunitarie innate e un’infiammazione cronica tipica della AGS. La correlazione tra disfunzione mitocondriale e segnalazione degli interferoni apre nuove prospettive terapeutiche, suggerendo il potenziale di approcci mirati alla modulazione dello stress mitocondriale e delle vie immunitarie, oltre alle strategie attuali focalizzate sulla rimozione degli acidi nucleici o sull’inibizione della risposta infiammatoria.