Studio della metilazione della regione D-loop e del numero di copie del DNA mitocondriale in pazienti con distrofia muscolare di Duchenne e Becker

Duchenne muscular dystrophy (DMD) and Becker muscular dystrophy (BMD) are two forms of dystrophinopathies, hereditary neuromuscular disorders linked to mutations in the dystrophin gene (DMD). Dystrophin is essential for the stability and functionality of muscle fibres; its almost complete absence is the basis of the most severe phenotype of the disease, namely DMD, while its synthesis in partially functional isoforms is associated with the less severe clinical form, namely BMD. Despite their common genetic origin, the clinical heterogeneity between the two dystrophies cannot be explained solely by the type of mutation, suggesting the possible contribution of secondary mechanisms, such as epigenetic processes and mitochondrial function, which may influence phenotypic expression and disease progression. A key role is played by the D-loop region of mitochondrial DNA (mtDNA), which is essential for the replication and transcription of mtDNA itself and, above all, is considered a region susceptible to epigenetic modifications, such as methylation, which can influence stability and copy number. The aim of the study was to evaluate the epigenetic and quantitative profile of mtDNA in patients with DMD and BMD, comparing them with healthy controls, through methylation analysis of the D-loop region and quantification of mitochondrial copy number. The analysis was performed on both muscle biopsies and peripheral blood samples to investigate whether the epigenetic alterations were specific to muscle tissue or could also be detected at the peripheral level, so that they could be used as possible biomarkers. The experimental part involved isolating DNA from samples of both tissues, quantifying the number of mtDNA copies by qPCR, and analysing D-loop methylation using pyrosequencing. The data obtained were then analysed to assess any significant differences between the groups. The analysis revealed a significant reduction in the number of copies in both muscle and peripheral blood, associated with an increase in methylation levels in the D-loop region. These results confirmed studies in the literature highlighting an inverse relationship between the two parameters of copy number and methylation. However, this inverse relationship did not occur in blood samples, most likely due to differences in regulatory mechanisms depending on the tissue analysed. The data reinforce the hypothesis that mitoepigenetics (mitochondrial epigenetics) plays a crucial role in dystrophinopathies, helping to explain the phenotypic variability observed between the two diseases. Furthermore, these alterations, which can be detected in the blood, could pave the way for the development of biomarkers capable of monitoring disease progression and response to possible future treatments.

La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) e la distrofia muscolare di Becker (BMD) sono due forme di distrofinopatie, patologie neuromuscolari ereditarie che sono legate a mutazioni sul gene della distrofina (DMD). La distrofina è fondamentale per la stabilità e la funzionalità della fibra muscolare; la sua assenza quasi completa è alla base del fenotipo più severo della malattia, ovvero la DMD, mentre la sua sintesi in isoforme parzialmente funzionati sono associate alla forma clinica meno grave, ovvero la BMD. Nonostante l’origine genetica comune, l’eterogeneità clinica tra le due distrofie non può essere spiegata unicamente dal tipo di mutazione, suggerendo quindi il possibile contributo di meccanismi secondari, quali i processi epigenetici e la funzionalità mitocondriale, potenzialmente in grado di influenzare l’espressione fenotipica e la progressione della malattia. Un ruolo chiave è assunto dalla regione D-loop del DNA mitocondriale (mtDNA), fondamentale per la replicazione e la trascrizione del mtDNA stesso, e soprattutto considerata come una regione suscettibile a modificazioni epigenetiche, come la metilazione, che possono influenzare la stabilità e il numero di copie. Lo scopo dello studio svolto è stato valutare il profilo epigenetico e quantitativo del mtDNA in pazienti affetti da DMD e BMD, mettendoli a confronto con controlli sani, attraverso analisi di metilazione della regione D-loop e quantificazione del copy number mitocondriale. L’analisi è stata effettuata sia su biopsie muscolari sia su campioni di sangue periferico per indagare se le alterazioni epigenetiche fossero specifiche del tessuto muscolare o possano essere rilevate anche a livello periferico, in maniera da poter essere utilizzare come possibili biomarcatori. La parte sperimentale ha previsto l’isolamento del DNA dai campioni di entrambi i tessuti, la quantificazione del numero di copie di mtDNA tramite qPCR e l’analisi della metilazione del D-loop attraverso la tecnica del pirosequenziamento. I dati ottenuti sono stati successivamente analizzati per valutare le eventuali differenze significative tra i gruppi. Dall’analisi è emersa una riduzione significativa del numero di copie sia a livello muscolare che di sangue periferico associata a un aumento dei livelli di metilazione della regione D-loop. Tali risultati hanno confermato studi in letteratura in cui viene evidenziata una relazione inversa tra i due parametri di copy number e metilazione. Tuttavia, nei campioni ematici questa relazione inversa non si è verificata, verosimilmente a causa di differenze di meccanismi di regolazione a seconda del tessuto analizzato. I dati rafforzano l’ipotesi che la mitoepigenetica (epigenetica mitocondriale) giochi un ruolo cruciale nelle distrofinopatie, contribuendo a spiegare la variabilità fenotipica osservabile tra le due malattie. Inoltre, queste alterazioni che possono essere rilevate a livello sanguigno potrebbero aprire la strada allo sviluppo di biomarcatori, in grado di monitorare lo sviluppo della malattia e la risposta a possibili trattamenti futuri.