Dalla zecca al genoma: analisi molecolari su Borrelia lusitaniae

The bacteria belonging to the Borrelia burgdorferi senso lato (Bbsl) species complex are the causative agent of Lyme disease (LD), the most common tick-borne disease in the Northern Hemisphere. Culturing Borrelia spirochetes from ticks is challenging and time-consuming. Of all the species belonging to this complex, Borrelia lusitaniae is one of the most fastidious to cultivate. This results in a lack of available B. lusitaniae isolates and genomes. The Borrelia PubMLST database currently contains data for 77 B. lusitaniae isolates and only one genome, while for the well studied species B. burgdorferi sensu stricto more than 1.800 isolates and 350 genomes are available. However, B. lusitaniae has been implicated in clinical cases of borreliosis and presents an interesting population structure that suggests adaptation to different ecological niches. To gain a better understanding of this understudied species, we aimed to isolate Borrelia from Ixodes ricinus ticks collected in Northern Italy (along the Ticino river, Province of Pavia), to generate and analyse whole genomes of B. lusitaniae isolates. Once the cultures were established, using a high-nutrient liquid culture medium, they were maintained under controlled conditions to avoid contaminations. DNA extraction was then performed and followed by molecular typing through Multi Locus Sequence Typing (MLST) to type the Borrelia strains using a set of eight genes that are amplified through a standard PCR protocol, and subjected to Sanger sequencing. During this project Whole-Genome Sequencing was then performed using the Oxford Nanopore Technology (ONT) method, resulting in long reads that were used to assemble the genome and perform further phylogenetic analysis. The results of the sequencing allowed us to generate genome assemblies that were used to produce phylogenetic trees that showed that Italian isolates cluster with central European B. lusitaniae isolates, both using the MLST sequences and the core genome MLST scheme. The newly isolated strains were also uploaded to the Borrelia PubMLST database, contributing to increasing the amount of data publicly available, and laying the basis for future studies aimed at better understanding the biology and pathogenicity of this understudied species.

I batteri appartenenti al complesso di specie di Borrelia burgdorferi sensu lato (Bbsl) sono responsabili per la trasmissione della Malattia di Lyme (LD), la malattia infettiva da zecca più prevalente nell’Emisfero Settentrionale. Coltivare le spirochete del genere Borrelia da zecche è laborioso, richiede tempo e attenzione. Di tutte le specie appartenenti al Bbsl, Borrelia lusitaniae è una delle più fastidiose da coltivare, per questo motivo il database Borrelia PubMLST contiene attualmente 77 isolati e un solo genoma di B. lusitaniae, mentre per B. burgdorferi sensu stricto, la specie più studiata, il database contiene più di 1.800 isolati e 350 genomi. Tuttavia, il ruolo patogeno di questa specie è attualmente dibattuto e la sua struttura di popolazione è interessante e sembra suggerire un adattamento a diverse nicchie ecologiche. Per comprendere meglio questi aspetti, il nostro lavoro si è concentrato sull’isolamento di nuove colture da zecche raccolte nel Nord Italia (lungo il fiume Ticino, Provincia di Pavia), per generare e analizzare nuovi genomi di B. lusitaniae. Una volta stabilite, le colture sono state mantenute in condizioni controllate per evitare contaminazioni. Il DNA è stato estratto dalle colture positive per eseguire il typing molecolare attraverso il Multi Locus Sequence Typing (MLST) per caratterizzare gli isolati di Borrelia grazie ad un set di otto geni che vengono amplificati mediante PCR e sequenziati con il metodo Sanger. Durante questo lavoro si è poi proceduto al sequenziamento dell’intero genoma dei ceppi isolati usando il sequenziamento Oxford Nanopore Technology (ONT), che permette di ottenere long-reads, usate per assemblare il genoma ed eseguire analisi filogenetiche sui nuovi campioni di B. lusitaniae. I risultati del sequenziamento ci hanno permesso di ottenere degli assemblati del genoma, per generare una serie di alberi filogenetici. Gli alberi, generati con lo schema MLST e core genome MLST hanno dimostrato che gli isolati italiani si raggruppano con gli isolati centro Europei di B. lusitaniae. I nuovi ceppi isolati dalle zecche italiane sono stati, inoltre, caricati sul database Borrelia PubMLST, contribuendo all’aumento dei dati pubblicamente disponibili e fornendo una base per studi successivi atti a un’migliore comprensione del potenziale patogeno di questa specie.