STUDIO DEI MECCANISMI MOLECOLARI ALLA BASE DELLA MALATTIA NEC

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a severe, multifactorial gastrointestinal disease that primarily affects preterm infants with a low birth weight. It is characterized by feeding intolerance, abdominal distension, bloody stools, and sepsis. While no specific genetic predisposition has been definitively associated with NEC, studies of monozygotic and dizygotic twins have indicated a familial component. In collaboration with Dr Alessandro Borghesi and his team at the San Matteo Hospital, we investigated a novel homozygous loss-of-function mutation in the FBXL17 gene, which was identified through genomic and bioinformatic analysis of a familial NEC case. We hypothesized that this mutation could be a genetic factor contributing to NEC pathogenesis. In this context, we analysed the inflammatory profile of NEC patient-derived fibroblasts and compared them with healthy donors, using RNA sequencing. NEC fibroblasts displayed abnormal activation of the type I interferon (IFN) and DNA damage response pathways, alongside elevated inflammation. This was confirmed by gene expression and immunofluorescence analyses. To further explore the biological impact of the FBXL17 loss-of-function (LOF) mutation, we generated an in vitro colorectal FBXL17 knockout (KO) cell line via CRISPR-Cas9 RNP nucleofection. Gene expression results suggest that this model accurately replicates the heightened IFN response observed in NEC cells. Restoring FBXL17 expression through lentiviral transduction in patient-derived fibroblasts and knockout (KO) cells enabled us to investigate whether the loss-of-function (LOF) mutation directly causes IFN dysregulation. Overexpression of the FBXL17 LOF variant correlated with persistent ISGs upregulation while restoring FBXL17 WT expression resulted in decreased IFN score in this model. Moreover, we observed an intrinsic hyposensitivity of NEC cells to type I IFN stimulants (poly (I:C) and IFNα). Finally, we investigated the function of paracrine IFN signalling by exposing NEC and HD fibroblasts to Ruxolitinib, a clinically approved JAK inhibitor. Treatment with Ruxolitinib significantly reduced IFN signalling in NEC fibroblasts. Overall, our findings suggest that loss of FBXL17 function contributes to the abnormal activation of the type I IFN pathway and may drive NEC pathogenesis. These results highlight the type I IFN pathway as a potential therapeutic target for severe forms of NEC.

L'enterocolite necrotizzante (NEC) è una malattia gastrointestinale multifattoriale che colpisce principalmente i neonati prematuri. È caratterizzata da intolleranza alimentare, distensione addominale, sangue nelle feci e sepsi. Sebbene nessuna predisposizione genetica sia stata associata in modo definitivo alla NEC, studi su gemelli monozigoti e dizigoti suggeriscono una componente familiare. In collaborazione con il dottor Alessandro Borghesi e il suo team dell'Ospedale San Matteo, abbiamo studiato una nuova mutazione omozigote con perdita di funzione nel gene FBXL17, identificata attraverso l'analisi genomica e bioinformatica di un caso familiare di NEC. Abbiamo ipotizzato che questa mutazione potesse essere un fattore genetico associato alla patogenesi della NEC. Pertanto, abbiamo analizzato il profilo infiammatorio dei fibroblasti derivati da questo paziente e li abbiamo confrontati con quelli di donatori sani, attraverso il sequenziamento dell'RNA. I fibroblasti NEC hanno mostrato un'attivazione anomala della via dell’interferone (IFN) e delle vie di risposta al danno al DNA, insieme a un'infiammazione elevata. Ciò è stato confermato dalle analisi dell'espressione genica e dall'immunofluorescenza. Per esplorare l'impatto biologico della mutazione con perdita di funzione (LOF) di FBXL17, abbiamo generato una linea cellulare in vitro di FBXL17 knockout (KO) colorettale tramite nucleofezione con CRISPR-Cas9. I risultati dell'espressione genica suggeriscono che questo modello replica accuratamente la risposta interferonica elevata osservata nelle cellule NEC. Il ripristino dell'espressione di FBXL17 attraverso la trasduzione lentivirale nei fibroblasti derivati da pazienti e nella linea knockout (KO), ci ha permesso di indagare se questa mutazione contribuisse direttamente ad una disregolazione della risposta interferonica. La sovraespressione della variante LOF di FBXL17 correlata ad una persistente sovraregolazione dei geni stimolati dall’interferone (ISG), mentre il ripristino dell'espressione di FBXL17 WT ha portato a una diminuzione dei livelli di risposta interferonica in questi modelli. Inoltre, abbiamo osservato un'iposensibilità intrinseca delle cellule NEC ad agenti stimolanti della via interferonica (poly (I:C) e IFNα). Infine, abbiamo studiato la funzione della segnalazione paracrina dell'IFN esponendo i fibroblasti dei pazienti NEC e dei donatori sani a Ruxolitinib, un inibitore clinicamente approvato della via JAK/STAT. Il trattamento con Ruxolitinib ha ridotto significativamente la segnalazione dell'IFN nei fibroblasti NEC e nei fibroblasti trasdotti per il ripristino dell’espressione di FBXL17. Nel complesso, i nostri risultati suggeriscono che la perdita della funzione di FBXL17 contribuisce all'attivazione anomala della via dell'IFN e può guidare la patogenesi della NEC. Questi risultati evidenziano la via dell'IFN come un promettente bersaglio terapeutico per le forme gravi di questa patologia.