Stress ossidativo indotto da KBrO3: analisi in citometria a flusso e imaging su epatociti murini

Il bromato di potassio (KBrO3) è una sostanza pro-ossidante in grado di indurre danno ossidativo al DNA, attraverso una serie di reazioni mediate dal glutatione che determinano l’ossidazione della guanina ad 8-oxoG. Grazie a tale caratteristica, il KBrO3 è particolarmente indicato nello studio dello stress ossidativo a livello nucleare, in quanto in grado di limitare gli effetti citoplasmatici. Per questo progetto è stato scelto di utilizzare, quale modello, cellule epatiche murine AML12, in considerazione dell’utilizzo diffuso di tale sostanza nell’industria alimentare. Data la limitata disponibilità di letteratura scientifica che affronti il tema delle condizioni sperimentali circa l’utilizzo del KBrO3 su linee cellulari sane, l’obiettivo iniziale è stato quello di identificare le condizioni di trattamento ideali per standardizzare gli esperimenti e rapportarli agli altri dati attualmente accessibili. La combinazione di molteplici tecniche, comprendenti (I) un’analisi multiparametrica in citometria a flusso, focalizzata su aspetti morfologici e analisi del segnale fluorescente derivante da staining supravitale, (II) analisi ultrastrutturali e (III) immunofluorescenza, ha permesso di identificare una concentrazione di KBrO3 10 mM come in grado di mantenere le cellule vitali senza compromettere i parametri morfologici, e di non indurre né modifiche nel ciclo cellulare né di agire in modo fase-specifico. A seguito della determinazione della concentrazione di utilizzo del KBrO3 sul modello in esame, l’attenzione è stata rivolta allo studio di potenziali alterazioni indotte a livello cromatinico e trascrizionale. È stato infatti dimostrato che il trattamento sia responsabile di difetti nell’export citoplasmatico di mRNA, come evidenziato tramite analisi di pulse-chase in seguito ad incorporazione di 5-bromouridina. Inoltre, analisi di live-cell imaging hanno mostrato la formazione di cluster di cromatina condensata, la cui permanenza nel nucleoplasma è associata al perdurare del danno indotto dal KBrO3. Questi dati sono in accordo con comuni fenomeni di risposta a diverse fonti di stress, come riportato in letteratura da studi precedenti focalizzati principalmente su stress termico. Tuttavia, i pochi studi presenti in letteratura sull’effetto del KBrO3, a livello di alterazioni topografiche nucleari, suggeriscano prevalentemente una risposta diretta verso l’induzione di un ambiente cromatinico favorevole alla trascrizione, con aumento della componente eucromatinica e corrispondente diminuzione di quella eterocromatinica. È plausibile che tali differenze possano essere attribuite alla scelta del modello cellulare: gli studi che hanno riportato tale riorganizzazione nucleare sono stati condotti su linee tumorali, mentre, a nostra conoscenza, questo è il primo studio focalizzato su cellule AML12. Future investigazioni potranno essere dirette per valutare possibili alterazioni di carattere epigenetico per meglio caratterizzare e confrontare i risultati con la letteratura attualmente disponibile sul tema del controllo dell’espressione genica. Complessivamente, la comprensione del legame tra stress cellulare e corrispondente regolazione dell’espressione genica può contribuire a chiarire i meccanismi alla base dell’insorgenza di diverse patologie, in cui la deregolazione dei normali livelli di espressione riveste un ruolo centrale.