Sviluppo di una metodica LC-MS/MS per la determinazione quantitativa di Mescalina, Dimetiltriptamina e Mitraginina su matrice cheratinica

This thesis is part of the PRIN-NO PANIC project, a multicentre project that aims to assess the prevalence of psychoactive substances among students enrolled in the degree course in medicine and surgery at the Universities of Pavia and Bologna in relation to stress. In this context, the objective of this thesis is to develop and optimise an LC-MS/MS method for the quantitative determination of Mescaline, N,N-Dimethyltryptamine (DMT) and Mitragynine in keratin matrices, in order to expand the panel of psychoactive substances monitored by the forensic toxicology laboratory. Two analytical approaches were developed: a traditional method based on solid-phase extraction (SPE), already in use in the laboratory, and an innovative method using M3 Comedical solvent extraction, which reduces analysis time and sample quantity and allows the identification of numerous substances in a single analysis. The thesis work involved the optimisation of chromatographic and ionisation parameters, the construction of calibration curves and the evaluation of the main validation criteria, such as sensitivity, linearity, accuracy, precision, matrix effect, recovery and possible carry-over. The results obtained with the SPE method confirmed the full reliability of the method, with quantification limits below 10 pg/mg and optimal performance in terms of linearity and repeatability. The M3 solvent extraction procedure also showed satisfactory performance compatible with the analytical requirements of the project, although it showed lower sensitivity than SPE. The SPE purification method ensured acceptable recovery values and a negligible matrix effect, whereas intense ion suppression was observed on all compounds when extracted with M3. The stability of the analytes in the autosampler was confirmed for up to 96 hours for Mescaline and DMT, while Mitragynine showed a significant decrease in signal beyond 72 hours, suggesting the need for rapid analysis to ensure reliable quantification. Overall, the results obtained allowed the set objectives to be fully achieved: the LC-MS/MS procedure developed proved suitable for the analysis of the three substances in the keratin matrix, contributing to expanding the toxicological investigation capabilities of the Forensic Toxicology Laboratory of the University of Pavia. Looking ahead, the application of the method to real samples will make it possible to verify its effectiveness in a concrete experimental context and to integrate toxicological data with information collected through questionnaires, enhancing the epidemiological interpretation of the phenomenon of psychoactive substance use in the university environment.

Il presente lavoro di tesi si inserisce nell’ambito del progetto PRIN-NO PANIC, un progetto multicentrico che ha l’obiettivo di valutare la diffusione di sostanze psicoattive tra gli studenti iscritti al corso di laurea di medicina e chirurgia dell’Università degli studi di Pavia e di Bologna in relazione allo stress. In tale contesto, l’obiettivo di questa tesi è lo sviluppo e l’ottimizzazione di una metodica LC-MS/MS per la determinazione quantitativa di Mescalina, N,N-dimetiltriptamina (DMT) e Mitraginina in matrice cheratinica, al fine di ampliare il pannello di sostanze psicoattive monitorate dal laboratorio di tossicologia forense. Sono stati messi a punto due approcci analitici: un metodo tradizionale basato su estrazione in fase solida (SPE), già in utilizzo nel laboratorio, e un metodo innovativo mediante estrazione con solvente M3 Comedical che consente di ridurre i tempi di analisi, il quantitativo di campione e di consentire l’identificazione di numerose sostanze in una sola analisi. Il lavoro di tesi ha previsto l’ottimizzazione dei parametri cromatografici e di ionizzazione, la costruzione delle curve di calibrazione e la valutazione dei principali criteri di validazione, quali sensibilità, linearità, accuratezza, precisione, effetto matrice, recupero ed eventuale carry-over. I risultati ottenuti con la metodica SPE hanno confermato la piena affidabilità del metodo, con limiti di quantificazione inferiori a 10 pg/mg e ottimali prestazioni in termini di linearità e ripetibilità. Anche la procedura estrattiva in solvente M3 ha mostrato performance soddisfacenti e compatibili con le esigenze analitiche del progetto, pur evidenziando una sensibilità inferiore rispetto alla SPE; mentre la metodica di purificazione con SPE ha garantito l’ottenimento di valori di recupero accettabili, oltre che un non rilevante effetto matrice, al contrario si è osservato un intenso fenomeno di ion suppression su tutti i composti, quando estratti con M3. La stabilità degli analiti in autosampler è stata confermata fino a 96 ore per Mescalina e DMT, mentre la Mitraginina ha mostrato una diminuzione significativa del segnale oltre le 72 ore, dato che suggerisce la necessità di analisi rapide per garantire l’affidabilità della quantificazione. Nel complesso, i risultati ottenuti hanno permesso di raggiungere pienamente gli obiettivi prefissati: la procedura LC-MS/MS sviluppata si è dimostrata idonea per l’analisi delle tre sostanze nella matrice cheratinica, contribuendo ad ampliare le capacità di indagine tossicologica del Laboratorio di Tossicologia Forense dell’Università degli Studi di Pavia. In prospettiva futura, l’applicazione del metodo a campioni reali permetterà di verificarne l’efficacia in un contesto sperimentale concreto e di integrare i dati tossicologici con le informazioni raccolte mediante questionari, potenziando l’interpretazione epidemiologica del fenomeno del consumo di sostanze psicoattive in ambiente universitario.