Sviluppo di una metodologia di analisi dell'ubiquitinoma per lo studio della trasduzione del segnale mediata da LRRK2 in fibroblasti embrionali murini wild-type e VPS35 D620N

Parkinson’s disease (PD) is a progressive neurodegenerative movement disorder characterized by the loss of dopaminergic neurons and the accumulation of misfolded proteins. The VPS35 [D620N] mutation, associated with familial PD, was found to enhance Leucine-rich Repeat Kinase-2 (LRRK2) activity and disrupt lysosomal protein levels through proteasomal degradation. However, the molecular mechanisms linking LRRK2 hyperactivation to the ubiquitin-proteasome system (UPS) are still not fully understood. This work focused on developing and optimizing a methodology for the comprehensive analysis of the ubiquitinome in wild-type and VPS35 [D620N] mouse embryonic fibroblasts (MEFs), to investigate LRRK2-mediated signalling. Three distinct protocols, based on different extraction methods (urea, SDS and sodium deoxycholate) were tested, and the resulting ubiquitinome data were compared. The optimized SDS-based workflow was chosen as the most suitable one as it proved to be reproducible and sensitive, while still being straightforward. Ubiquitinome profiling revealed that VPS35 [D620N] MEFs display increased ubiquitylation of LRRK2-dependent endolysosomal proteins, including several Rab GTPases (LRRK2 substrates). This is consistent with the enhanced LRRK2 kinase activity observed in the mutant. Moreover, pharmacological inhibition of LRRK2 with MLi-2 markedly reduced the ubiquitylation of these substrates, as well as Hedgehog-, Parkinson's disease- and UPS-associated proteins when compared to their levels in the WT. Quantitative proteomics showed increased steady-state protein levels upon LRRK2 inhibition in the VPS35 [D620N] background. Collectively, these findings suggest that hyperactivation of LRRK2 in VPS35 [D620N] cells may lead to the degradation of specific signalling components via ubiquitylation, whereas inhibition of LRRK2 restores their whole-cell levels. Overall, this study established a robust analytical methodology for ubiquitinome profiling and provides new insights into the molecular interplay between LRRK2 and the ubiquitin-proteasome system in Parkinson’s disease pathogenesis.

Il morbo di Parkinson è una patologia neurodegenerativa progressiva, associata a sintomatologia motoria e non motoria, caratterizzata dalla perdita dei neuroni dopaminergici e dall'accumulo di proteine misfolded. Da studi pregressi è emerso che la mutazione [D620N] di VPS35, associata a forme ereditarie di Parkinson, causa un aumento dell'attività chinasica di LRRK2 (Leucine-rich Repeat Kinase-2) e altera i livelli delle proteine lisosomiali attraverso la degradazione proteosomica. Tuttavia, i meccanismi molecolari che legano l'iperattivazione di LRRK2 al sistema ubiquitina-proteosoma (UPS) non sono ancora del tutto chiari. Questo lavoro di ricerca si è concentrato sullo sviluppo e l'ottimizzazione di una metodologia per l'analisi completa dell'ubiquitinoma in fibroblasti embrionali murini (MEF) wild-type e VPS35 [D620N], al fine di studiare la segnalazione mediata da LRRK2. Sono stati testati tre protocolli distinti, basati su diversi metodi di estrazione (urea, SDS e desossicolato di sodio), e sono stati confrontati i dati dell'ubiquitinoma ottenuti. Tra le tre metodologie, quella basata su SDS è stata ritenuta la più adatta allo scopo previsto, in quanto il metodo si è dimostrato riproducibile, sensibile e di facile applicazione. Il profilo dell'ubiquitinoma ha rivelato che i MEF VPS35 [D620N] mostrano un aumento dell'ubiquitinazione delle proteine endolisosomiali dipendenti da LRRK2, tra cui diverse Rab GTPasi (substrati di LRRK2). Ciò è coerente con l'aumentata attività enzimatica di LRRK2 osservata nel mutante. Inoltre, l'inibizione farmacologica di LRRK2 con MLi-2 ha ridotto notevolmente l'ubiquitinazione di questi substrati, così come delle proteine associate a Hedgehog, al morbo di Parkinson e all'UPS in confronto ai loro livelli nel WT. Dall’analisi proteomica quantitativa è emerso un aumento dei livelli proteici allo stato stazionario in seguito all'inibizione di LRRK2 nel contesto VPS35 [D620N]. Nel complesso, questi risultati suggeriscono che l'iperattivazione di LRRK2 nelle cellule VPS35 [D620N] può portare alla degradazione di specifici componenti di segnalazione tramite ubiquitinazione, mentre l'inibizione di LRRK2 ripristina i loro livelli cellulari. In conclusione, questo studio ha stabilito una metodologia analitica robusta per la caratterizzazione dell'ubiquitinoma e ha permesso di ottenere informazioni preliminari sull'interazione molecolare tra LRRK2 e il sistema ubiquitina-proteosoma nella patogenesi del morbo di Parkinson.