Sviluppo e caratterizzazione di una libreria di peptidi per lo studio del meccanismo di proteolisi di SDE2 mediato da USP5

Posttranslational modifications (PTMs) are chemical variations at the aminoacidic level that can modulate protein functions and regulate stress response pathways. Among these, the proteolytic removal of ubiquitin like domains is a key regulatory step. The protein Silencing Defective 2 (SDE2) is synthesised with an N terminal ubiquitin like domain (SDE2UBL) that must be cleaved by the deubiquitinating enzyme USP5 (Ubiquitin Specific Protease 5) to generate the active C terminal fragment (SDE2CT), that participates in DNA repair, ribosome biogenesis and mRNA splicing. SDE2 processing occurs at lysine 78 (K78), downstream the conserved G76G77 motif. Preliminary data from an in vitro assay performed by incubating USP5 with 25-amino-acid peptide representing SDE266–90 sequence revealed two additional cleavage sites beyond the one previously reported. This finding raised the hypothesis that additional sequence or structural determinants might influence substrate recognition and processing. In this thesis, the sequence determinants required for SDE2UBL processing were investigated, to elucidate the mechanism of SDE2 maturation and ultimately support the design of USP5 inhibitors or modulators. To do so, a library of peptides has been designed, mutating the sequence of the original peptide, and tested in an in-vitro assay and analysed by MALDI-TOF. The analysis revealed that cleavage occurred exclusively at lysine and arginine residues, regardless of the identity of amino acids in the sequence. However, the observed cleavage pattern was not replicated when a new batch of recombinant USP5 was employed in the assay, raising the possibility that a non-specific protease contaminant had been present in the initial preparation. Subsequent proteomic analysis of both batches identified Oligopeptidase B, a contaminant from E. coli, present exclusively in the first batch, suggesting that this enzyme was responsible for the observed peptide cleavage activity.

Le modificazioni post-traduzionali (PTMs) sono variazioni chimiche a livello amminoacidico che possono modulare le funzioni proteiche e regolare i meccanismi di risposta a stress cellulari. Tra queste, la rimozione dei domini, incluso i domini ubiquitin-like, rappresenta un passaggio regolatorio chiave. La proteina Silencing Defective 2 (SDE2) viene sintetizzata con un dominio N-terminale ubiquitin-like (SDE2UBL), che deve essere rimosso dall’enzima deubiquitinante USP5 (Ubiquitin Specific Protease 5) per generare il frammento C-terminale attivo (SDE2CT), che partecipa alla riparazione del DNA, alla biogenesi dei ribosomi e allo splicing dell’mRNA. La maturazione di SDE2 avviene in corrispondenza della lisina 78 (K78), dove è localizzato il motivo G76G77. Dati preliminari provenienti da un saggio in vitro eseguito incubando USP5 con un peptide di 25 amminoacidi rappresentante la sequenza SDE266-90 hanno rivelato due siti di idrolisi aggiuntivi oltre a quello precedentemente riportato. Questo risultato ha sollevato l’ipotesi che ulteriori componenti della sequenza o struttura potessero influenzare il riconoscimento e la maturazione del substrato. In questa tesi sono stati investigati i residui della sequenza necessari per il processing di SDE2UBL, con l’obiettivo di chiarire il meccanismo di maturazione di SDE2 e, in ultima analisi, supportare la progettazione di inibitori o modulatori di USP5. A tal fine, è stata progettata una libreria di peptidi con mutazioni nella sequenza del peptide originale, e i peptidi sono stati testati utilizzando lo stesso approccio. L’analisi ha rivelato che l’idrolisi avveniva esclusivamente in corrispondenza di residui di lisina e arginina, indipendentemente dall’identità degli altri amminoacidi nella sequenza. Tuttavia, il pattern osservato non è stato replicato quando un nuovo lotto di USP5 ricombinante è stato utilizzato nel saggio, suggerendo la possibile presenza di una contaminazione da proteasi aspecifica nella preparazione iniziale. La successiva analisi proteomica di entrambi i lotti ha identificato l’Oligopeptidasi B, un contaminante proveniente da E. coli, presente esclusivamente nel primo lotto, indicando che tale enzima fosse responsabile dell’attività osservata.[