Analisi Trascrittomica a Singola Cellula dell'Interazione Differenziale tra IL-17A e IL-17F nell'Epitelio Bronchiale Umano Primario durante l'Omeostasi e l'Infezione da Pseudomonas Aeruginosa

L'Interleuchina-17A (IL-17A) e l'Interleuchina-17F (IL-17F) sono citochine critiche nell'immunità mucosale, agendo spesso come fattori chiave della patologia nelle malattie croniche delle vie aeree come la Fibrosi Cistica e la BPCO. Nonostante condividano un complesso recettoriale (IL-17RA/IL-17RC) e mostrino omologia strutturale, i contributi distinti di queste citochine alla difesa epiteliale e la loro interazione rimangono poco compresi. Il paradigma prevalente considera l'IL-17F principalmente come un'isoforma meno potente dell'IL-17A. Questa tesi esplora tale paradigma dissezionando sistematicamente le risposte trascrittomiche specifiche per lignaggio dell'epitelio bronchiale umano primario (pHBEC) all'IL-17A, all'IL-17F e alla loro combinazione, sia in condizioni omeostatiche che durante l'infezione da Pseudomonas aeruginosa. Le pHBEC sono state coltivate all'interfaccia aria-liquido (ALI) per modellare la barriera fisiologica delle vie aeree e sottoposte a sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) con multiplexing tramite hashtag oligonucleotide (HTO) per minimizzare gli effetti del lotto (batch effects). Per generare ipotesi riguardanti la complessa logica combinatoria della segnalazione citochinica in assenza di replicati biologici, è stato sviluppato un framework di classificazione computazionale personalizzato basato sul modello "Highest Single Agent" (HSA), categorizzando le interazioni geniche in profili sinergici, antagonistici o dominanti. L'analisi conferma innanzitutto che entrambe le citochine guidano un core infiammatorio canonico condiviso tra tutti i tipi cellulari, caratterizzato dall'induzione di chemochine per la mobilizzazione dei neutrofili (CSF3, CCL20), reagenti della fase acuta (LCN2, SAA1/2) e regolatori a feedback negativo (ZC3H12A), come previsto. Oltre a questa ridondanza condivisa, viene rivelata una profonda divergenza funzionale. L'IL-17A sembra funzionare come un "acceleratore" dell'infiammazione acuta e un ponte verso l'immunità adattativa, guidando specificamente l'up-regolazione del macchinario di presentazione dell'antigene HLA di Classe I e di Classe II rispettivamente nelle cellule Basali e Ciliate. Al contrario, l'IL-17F sembra guidare un distinto programma di "rimodellamento e risoluzione". Questa firma è caratterizzata dall'induzione di geni associati al profilo Th2 (CCL26, ALOX15), componenti strutturali del muco (FCGBP) e regolatori negativi della segnalazione citochinica (SOCS1, CISH), suggerendo un ruolo nell'integrità mucosale e nello smorzamento dell'infiammazione piuttosto che in una escalation acuta. Inoltre, lo studio svela un'interazione complessa e non additiva tra le citochine. Nelle cellule secretorie, l'IL-17F sopprime attivamente le allarmine guidate dall'IL-17A (S100A8/A9), agendo come un potenziale freno alla progressione dell'infiammazione. Nel contesto dell'infezione da P. aeruginosa, questa dicotomia funzionale risulta amplificata. L'IL-17F emerge come il regolatore dominante del rinforzo della barriera (POSTN, LOXL4) e dell'attivazione del complemento terminale (C8A, C8B), distinto dalla risposta puramente neutrofila guidata dall'IL-17A. Collettivamente, queste osservazioni suggeriscono un modello rivisto di immunità epiteliale in cui l'IL-17A agisce come iniziatore rapido della difesa dell'ospite, mentre l'IL-17F funziona come un "modulatore" che facilita il rimodellamento e la risoluzione, insieme alle sue caratteristiche pro-infiammatorie che suggeriscono un ruolo di bilanciamento. Questo lavoro fornisce una descrizione ad alta risoluzione di queste interazioni, suggerendo che le strategie terapeutiche mirate al pathway dell'IL-17 debbano evolvere oltre il blocco generico verso approcci di precisione su misura per specifiche patologie guidate dalle citochine.

Interleukin-17A (IL-17A) and Interleukin-17F (IL-17F) are critical cytokines in mucosal immunity, often acting as key drivers of pathology in chronic airway diseases such as Cystic Fibrosis and COPD. Despite sharing a receptor complex (IL-17RA/IL-17RC) and exhibiting structural homology, the distinct contributions of these cytokines to epithelial defense and their interplay remain poorly understood. The prevailing paradigm views IL-17F primarily as a less potent isoform of IL-17A. This thesis explores this paradigm by systematically dissecting the lineage-specific transcriptomic responses of the primary human bronchial epithelium (pHBEC) to IL-17A, IL-17F, and their combination, both under homeostatic conditions and during Pseudomonas aeruginosa infection. pHBECs were cultured at the Air-Liquid Interface (ALI) to model the physiological airway barrier and subjected to single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) with hashtag oligonucleotide (HTO) multiplexing to minimize batch effects. To generate hypotheses regarding the complex combinatorial logic of cytokine signaling without biological replicates, a custom computational classification framework based on the Highest Single Agent (HSA) model was developed, categorizing gene interactions into synergistic, antagonistic, or dominant profiles. The analysis first indicates that both cytokines drive a shared, canonical inflammatory core across all cell types, characterized by the induction of neutrophil-mobilizing chemokines (CSF3, CCL20), acute-phase reactants (LCN2, SAA1/2), and negative feedback regulators (ZC3H12A), as expected. Beyond this shared redundancy, a profound functional divergence is revealed. IL-17A appears to function as an "accelerator" of acute inflammation and a bridge to adaptive immunity, specifically driving the upregulation of HLA Class I and Class II antigen presentation machinery in Basal and Ciliated cells, respectively. In contrast, IL-17F appears to drives a distinct "remodeling and resolution" program. This signature is characterized by the induction of Th2-associated genes (CCL26, ALOX15), mucus structural components (FCGBP), and negative regulators of cytokine signaling (SOCS1, CISH), suggesting a role in mucosal integrity and inflammation dampening rather than acute escalation. Furthermore, the study uncovers complex, non-additive interplay between the cytokines. In secretory cells, IL-17F actively suppresses IL-17A-driven alarmins (S100A8/A9), acting as a potential brake on inflammation progression. In the context of P. aeruginosa infection, this functional dichotomy is amplified. IL-17F appears to be a primary regulator of barrier reinforcement (POSTN, LOXL4) and terminal complement activation (C8A, C8B), distinct from the pure neutrophilic response driven by IL-17A. Collectively, these observations suggest a revised model of epithelial immunity where IL-17A acts as the rapid initiator of host defense, while IL-17F functions as a "modulator" facilitating remodeling and resolution along with its pro-inflammatory features suggesting a balancing role. This work provides a hypothesis-generating description of these interactions, suggesting that therapeutic strategies targeting the IL-17 pathway must move beyond broad blockade toward precision approaches tailored to specific cytokine driven pathologies.