Impatto dei metodi di conservazione sul potenziale terapeutico del secretoma e delle vescicole extracellulari derivati da cellule staminali mesenchimali amniotiche (AMSC): un'analisi comparativa in vitro su linee cellulari cardiovascolari.

Mesenchymal stem cell (MSC)-based therapy represents a promising strategy for myocardial repair, largely through paracrine mechanisms mediated by the secretome and extracellular vesicles (EVs). Human amniotic MSCs (hAMSCs) are an attractive source for regenerative cardiovascular applications due to their high proliferation capacity, low immunogenicity, and non-invasive collection. However, clinical translation of secretome-based therapies remains limited by the absence of standardised storage protocols and insufficient understanding of how preservation conditions affect therapeutic potency. This thesis investigated the impact of storage temperature (4 °C and -80 °C) and duration (5 and 15 days) on the structural and functional stability of hAMSC-derived conditioned medium (CM) and small extracellular vesicles (sEVs). The cytoprotective, anti-oxidant and pro-angiogenic effects of fresh and stored samples were assessed by quantifying viability and ROS production in H9c2 rat cardiomyoblasts exposed to hypoxia/reoxygenation injury, or tube formation assay with human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Particle concentration and size distribution were analysed via NTA to evaluate physical stability. Fresh CM demonstrated the strongest therapeutic performance, significantly improving cell viability, reducing oxidative stress, and stimulating angiogenesis. Storage resulted in a progressive loss of biological activity, with distinct effects depending on temperature and functional readout. Short-term refrigeration preserved cytoprotection better than -80 °C, while angiogenic capacity was better maintained at -80 °C. Antioxidant function was the most storage-sensitive and was completely lost under all storage conditions. sEVs alone showed limited functional activity and failed to preserve therapeutic effects following storage. Although -80 °C effectively maintained vesicle physical properties, this did not correlate with preserved biological function. These findings underscore that physical stability cannot be assumed to represent biological efficacy, highlight the complexity of preserving paracrine factors, and emphasise that fresh CM remains superior to stored preparations. Future research must prioritise validation of preservation strategies for in vivo use, where real therapeutic effectiveness and safety can be adequately evaluated, as maintaining biological activity is essential for clinical feasibility.

La terapia cellulare con cellule staminali mesenchimali (MSC) rappresenta una strategia promettente per la riparazione miocardica, che agisce principalmente attraverso meccanismi paracrini mediati dal secretoma e dalle vescicole extracellulari (EV). Le cellule staminali mesenchimali isolate dalla membrana amniotica della placenta umana (hAMSC) costituiscono una fonte particolarmente interessante per la cura delle malattie cardiovascolari, grazie alla loro possibilità di essere prelevate in maniera non invasiva, alla loro elevata capacità proliferativa, ed alla bassa immunogenicità. Tuttavia, la traslazione clinica delle terapie basate sul secretoma rimane difficile, anche per la carenza di protocolli di conservazione standardizzati, e per una parziale comprensione di come le condizioni di stoccaggio influenzino l'efficacia terapeutica. In questa tesi è stato studiato l'impatto della temperatura (4 °C e -80 °C) e della durata della conservazione (5 e 15 giorni) sulla stabilità strutturale e funzionale del mezzo condizionato (CM) e delle piccole vescicole extracellulari (sEV) derivate da hAMSC. Utilizzando modelli di danno da ipossia/riossigenazione in vitro su cardiomioblasti di ratto H9c2, e saggi di formazione di tubi in HUVEC, sono state valutate le attività citoprotettive, anti-ossidanti e pro-angiogeniche dei campioni freschi e di quelli conservati. La concentrazione e la distribuzione dimensionale delle microvescicole sono state analizzate mediante NTA (Nanoparticle Tracking Analysis) per valutarne la stabilità fisica. Il CM fresco ha dimostrato la massima efficacia terapeutica, migliorando significativamente la vitalità cellulare, riducendo lo stress ossidativo e stimolando l'angiogenesi. La conservazione ha determinato una progressiva perdita di attività biologica, con effetti diversi a seconda della temperatura e del parametro funzionale considerato. La refrigerazione a breve termine ha preservato la citoprotezione meglio del congelamento a -80 °C, mentre la capacità angiogenica è stata mantenuta in modo più efficace a -80 °C. La funzione antiossidante si è rivelata la più sensibile alla conservazione, risultando completamente persa in tutte le condizioni sperimentate. Le sEV da sole hanno mostrato un'attività funzionale limitata e non sono riuscite a preservare gli effetti terapeutici dopo lo stoccaggio. Sebbene la temperatura di -80°C ha mantenuto efficacemente le proprietà fisiche delle vescicole, ciò non si è tradotto in un analogo mantenimento della loro funzione biologica. Questi risultati evidenziano come la stabilità fisica non possa essere considerata un indicatore affidabile dell'efficacia biologica, sottolineano la complessità intrinseca alla conservazione dei fattori paracrini ed enfatizzano la superiorità del CM fresco rispetto ai preparati conservati. La ricerca futura dovrà prioritariamente convalidare le strategie di conservazione per uso in vivo, dove l'efficacia terapeutica e la sicurezza reale possono essere valutate in modo adeguato, poiché il mantenimento dell'attività biologica è un requisito essenziale per la fattibilità clinica.