Studio del meccanismo molecolare della demetilazione del recettore degli androgeni mediata da LSD1

Expansion over 38 repeats of the polymorphic CAG tandem repeat in the first exon of the Androgen Receptor gene (AR) causes Spinal and Bulbar Muscular Atrophy (SBMA), an inherited, slowly progressive neurodegenerative disease that fully manifests only in males. Androgen binding to polyQ-expanded AR triggers SBMA through a combination of toxic gain-of-function (GOF) and loss-of-function (LOF) mechanisms that lead to motor neuron loss, muscle atrophy, mild androgen insensitivity syndrome, and metabolic syndrome. Androgen binding to the androgen receptor results in its traslocation into the nucleus, binding to DNA, recruitment of transcription co-regulators (coactivators and corepressors), and regulation of target genes’ expression. We previously investigated the role of two AR coregulators, namely lysine-specific demethylase 1 (LSD1) and protein arginine methyltransferase (PRMT6), in SBMA skeletal muscle, confirming that they both work as disease modifiers (Prakasam et al.,2023). LSD1 and PRMT6 mainly work as histone writers, but they work also on non-histone proteins’ post translation modifications. It has already been previously demonstrated that PRMT6-mediated arginine methylation increases the toxicity of AR with expanded polyQ by preventing phosphorylation by Akt kinase and thus the consequent degradation of the receptor. The aim of this project is to explore a possible LSD1-mediated lysine demethylation of the AR. Our findings suggest that LSD1 is able to modifiy the lysine methylation status of the non-expanded (AR24Q) and polyQ-expanded (AR65Q) AR , acting on one or more lysine residues on AR sequence. Starting from the literature data, we selected some candidate lysines, in particular focusing on the K630LK632K633 motif present in the hinge region of the receptor. We mutagenized the lysines at position 632 and 633 into arginines (KxRR) or alanines (KxAA) and we characterized these lysine methylation defective mutants in both AR24Q and AR65Q, in terms of stabilization after ligand binding (DHT) and transactivation. Preliminary results obtained , through overexpression and silencing of LSD1, suggest that lysines 632 and 633 may be two lysines involved in the control of AR transactivation by LSD1. These findings require further validation to further clarify that this KxKK motif may be important for modulating receptor activity and elucidating the mechanism underlying the interaction between LSD1 and AR and how this could be relevant for SBMA pathogenesis.

L’espansione di oltre 38 ripetizioni della sequenza ripetuta e polimorfica CAG, codificante un tratto di poliglutammina (polyQ), nel primo esone del gene del Recettore degli Androgeni (AR) provoca l’atrofia muscolare spinale bulbare (SBMA o malattia di Kennedy), una malattia neurodegenerativa progressiva ereditaria che si manifesta pienamente solo nei maschi. Il legame degli androgeni all’AR con polyQ espanso provoca la malattia di Kennedy attraverso una combinazione di meccanismi tossici di guadagno di funzione (GOF) e di perdita di funzione (LOF) che portano alla degenerazione dei motoneuroni, atrofia muscolare, lieve insensibilità agli androgeni e sindrome metabolica. Il legame degli androgeni al recettore determina la sua traslocazione nel nucleo, il legame al DNA, il reclutamento di co-regolatori della trascrizione (coattivatori e corepressori) e la regolazione dell'espressione dei geni target. E’ stato precedentemente indagato il ruolo di due coregolatori di AR, protein arginine methyltransferase 6 (PRMT6) e lysine-specificdemethylase1 (LSD1), nel muscolo scheletrico SBMA, confermando che agiscono come modificatori della malattia (Prakasam et al., 2023). Sia LSD1 che PRMT6 operano principalmente come modificatori istonici, ma agiscono anche su modificazioni post-traduzionali di proteine non istoniche.Le modifiche post-traduzionali sono cruciali per la funzione e l’attività dell’AR. E’ già stato precedentemente dimostrato che la metilazione delle arginine mediata da PRMT6 aumenta la tossicità dell’AR con polyQ espanso prevenendo la fosforilazione da parte della chinasi Akt e quindi la conseguente degradazione del recettore. Lo scopo di questo lavoro è esplorare una possibile demetilazione delle lisine mediata da LSD1 sulla sequenza amminoacidica di AR. I risultati ottenuti suggeriscono che LSD1 sia in grado di modificare lo stato di metilazione delle lisine sia dell’AR non espanso (AR24Q) che con polyQ espanso (AR65Q), agendo su uno o più residui di lisina sulla sequenza di AR. Partendo da dati presenti in letteratura, abbiamo selezionato alcune lisine candidate, in particolare soffermandoci sul motivo K630xK632K633 presente nella regione cerniera (hinge region) del recettore. Abbiamo mutagenizzato le lisine in posizione 632 e 633 sostituendole con residui di arginina (mutanti denominati KxRR) o con residui di alanina (mutanti denominati KxAA) e abbiamo caratterizzato i corrispondenti mutantiAR24Q e AR65Q lysine methylation defective in termini di stabilizzazione e attivazione in seguito al legame del ligando. I risultati preliminari ottenuti, attraverso l’overespressione e il silenziamento di LSD1, suggeriscono che le lisine 632 e 633 potrebbero essere due lisine coinvolte nel controllo della transattivazione dell’AR da parte di LSD1. Questi risultati necessitano di ulteriori validazioni per chiarire ulteriormente che questo motivo KxKK possa essere importanti per modulare l’attività del recettore e per elucidare il meccanismo sottostante l’interazione tra LSD1 e AR e come questo possa essere rilevante per la patogenesi della malattia di Kennedy.