Analisi integrata del ruolo dei miRNA e del microbiota del suolo nella manifestazione della resistenza al glifosate in Echinochloa crus-galli (L.) P. Beauv. nei vigneti dell’Oltrepò Pavese

Herbicide resistance is a major phytosanitary problem, causing substantial crop yield losses and economic damage. While research has traditionally focused on identifying and managing resistant weed populations, recent studies highlight the complexity of resistance, which arises from interactions among plant genetics, physiology, epigenetic modifications and environmental conditions. Understanding these interactions is crucial for developing effective and sustainable weed management strategies. Among resistant weeds, Echinochloa crus-galli (L.) P. Beauv. is highly problematic and widespread, particularly in rice fields, but also in vineyards and other cropping systems, demonstrating notable ecological adaptability. According to GIRE, E. crus-galli has evolved resistance to multiple herbicide modes of action (MoAs), especially ALS and ACCase inhibitors, complicating chemical control. However, cases of glyphosate resistance have never been reported. This Master’s thesis examined E. crus-galli populations reported by winegrowers in Oltrepò Pavese vineyards as survived glyphosate (Roundup®) application. The study addressed three objectives: (i) evaluating the role of miRNAs in regulating genes associated with herbicide resistance, including EPSPS, ABC transporters, and AKR proteins, in glyphosate-resistant and -susceptible biotypes; (ii) characterizing vineyard soils in terms of management practices applied, physical-chemical properties and microbial community composition (Bacteria, Archaea, and Fungi); (iii) investigating relationships between vineyard management practices, soil properties, microbial communities and glyphosate resistance occurrence. Susceptibility or resistance toward glyphosate was assessed via herbicide application trials. The presence of 106-Pro EPSPS mutation was investigated using RFLP analysis: no specimens carried this mutation, indicating TSR absence in the studied populations. Parallel analyses assessed the expression of predicted miRNAs targeting EPSPS, ABC transporter, and AKR genes using relative-qPCR before and after glyphosate application. Resistant and susceptible biotypes showed distinct expression patterns: miR162, miR5564c-5p, miR5490, and miR5154 were not induced in resistant plants, allowing ABC transporters and AKRs expression and herbicide detoxification, while miR169q was induced, down-regulating EPSPS gene. Susceptible biotypes showed similar trends, but at lower levels. The five analyzed miRNAs have never been detected in E. crus-galli or linked to herbicide resistance, representing a novel insight. Soil chemistry was strongly influenced by vineyard inter-row management, affecting nutrient availability, organic matter dynamics, and fertility. Microbial community analyses revealed two distinct profiles associated with E. crus-galli glyphosate resistant biotypes (one including KD4-96, MB-A2-108, Haliangiales, Rokubacteriales, Pyrinomonadales, Dongiales, Pedospherales, Agaricales, Microascales and Rhizophydiales, and a second comprising Acidobacteriales, Microtrichales, Thelebolales, and GS16) and one profile associated with susceptible biotypes, including Thermomicrobiales, Azospirillales, Blastocatellales, Cytophagales, Chitinophagales, Bacillales, Micrococcales, Streptosporangiales, Sordariales and Glomerellales. These results suggest that soil microbial composition may influence glyphosate resistance occurrence in E. crus-galli and supports the hypothesis that soil microbial composition could be used as predictor of the development of resistant weeds in a field. Overall, these results emphasize the potential of miRNAs as bio-pesticides in substitution with conventional ones, for a sustainable weed management. A comprehensive understanding of E. crus-galli miRNAs, their target genes, and environmental modulators could enable indirect control of resistance, reducing chemical reliance and promoting more sustainable agricultural practices

La resistenza agli erbicidi rappresenta un rilevante problema fitosanitario, con conseguenti perdite significative di produzione e danni economici. Sebbene la ricerca si sia storicamente concentrata sull’identificazione e gestione delle popolazioni di infestanti resistenti, studi recenti ne evidenziano la complessità, derivante dall’interazione tra genetica vegetale, fisiologia, modificazioni epigenetiche e fattori ambientali. Comprendere questi processi è fondamentale per sviluppare strategie di gestione delle infestanti più efficaci e sostenibili. Tra le specie resistenti, Echinochloa crus-galli (L.) P. Beauv. è particolarmente problematica e diffusa, soprattutto nelle risaie, ma anche nei vigneti e in altri sistemi colturali, dimostrando una notevole adattabilità ecologica. Secondo il GIRE, E. crus-galli ha sviluppato resistenza a diversi MoAs, in particolare agli ALS e ACCase inibitori. Non sono, tuttavia, mai stati segnalati casi di resistenza al glifosate in questa specie. Questa tesi ha analizzato popolazioni di E. crus-galli segnalate dai viticoltori dell’Oltrepò Pavese come sopravvissute all’applicazione di glifosate. Lo studio ha perseguito tre obiettivi: (i) valutare il ruolo dei miRNA nella regolazione dei geni associati alla resistenza, tra cui EPSPS, trasportatori ABC e proteine AKR, in biotipi resistenti e suscettibili; (ii) caratterizzare i suoli dei vigneti in termini di pratiche di gestione del suolo, proprietà fisico-chimiche e composizione delle comunità microbiche (Batteri, Archea e Funghi); (iii) indagare le relazioni tra pratiche di gestione del vigneto, caratteristiche del suolo, comunità microbiche e presenza di resistenza al glifosate. La suscettibilità o resistenza al glifosate è stata valutata tramite prove di applicazione dell’erbicida. La presenza della mutazione 106-Pro nel gene EPSPS è stata analizzata mediante RFLP: nessun esemplare l’ha presentata, confermando l’assenza di TSR negli esemplari studiati. È stata analizzata l’espressione di 5 miRNA e dei relativi geni bersaglio (EPSPS, trasportatori ABC e AKR) mediante realtimePCR, prima e dopo l’applicazione di glifosate. Nei biotipi resistenti la trascrizione di miR162, miR5564c-5p, miR5490 e miR5154 non è mai stata indotta dal diserbo, consentendo l’espressione dei relativi geni bersaglio e la detossificazione dell’erbicida. Il miR169q è stato invece indotto, down-regolando EPSPS. Nei biotipi suscettibili si osservava un andamento simile, ma a livelli inferiori. I miRNA analizzati in questo lavoro non sono mai stati validati in E. crus-galli né associati alla resistenza agli erbicidi, rappresentando un risultato innovativo. Inoltre, la chimica del suolo è risultata fortemente influenzata dalla gestione delle interfila nei vigneti. L’analisi delle comunità microbiche ha evidenziato due profili microbici distinti nei vigneti in cui erano presenti biotipi resistenti al glifosate e un profilo microbico diverso nei vigneti in cui erano presenti biotipi suscettibili Questi risultati suggeriscono che la composizione microbica del suolo potrebbe influenzare la comparsa di resistenza al glifosate in E. crus-galli e supportano l’ipotesi che essa possa essere utilizzata per prevedere lo sviluppo di infestanti resistenti in un campo. Lo studio evidenzia inoltre il potenziale dei miRNA ad essere utilizzati come bio-pesticidi in sostituzione ai convenzionali formulati, per una gestione sostenibile delle infestanti. Una conoscenza approfondita dei miRNA di E. crus-galli, dei loro geni bersaglio e dei fattori ambientali che ne regolano l’espressione potrebbe consentire il controllo indiretto della resistenza agli erbicidi, riducendo la dipendenza da prodotti chimici e promuovendo pratiche agricole più sostenibili.