Family based whole genome sequencing in a cohort of undifferentiated (and related) connective tissue diseases

Connective tissue diseases (CTD) are a heterogeneous group of systemic autoimmune diseases characterized by chronic inflammation of connective tissues, immune dysregulation, and potential involvement of multiple organs. These diseases are commonly associated with the presence of autoantibodies, including antinuclear antibodies (ANA), indicating systemic autoimmunity. Undifferentiated connective tissue disease (UCTD) describes affected individuals who show clinical and serological features of systemic autoimmunity but do not meet the classification requirements for a defined CTD. Although UCTD is often considered less severe, approximately one-third of subjects progress into a defined CTD within the first five years of disease onset. While genetic factors are known to contribute to susceptibility in many CTDs, the genetic basis of UCTD still remains largely unclear. However, advances in whole genome sequencing (WGS) allow for the detection of rare disease-causing variants. In this study, we investigated the genetic background of 52 affected individuals from 26 unrelated families from Italy, all diagnosed with UCTD or with a defined CTD using a family based WGS approach. Genomic DNA was extracted from peripheral blood samples and sequenced using the Illumina NovaSeq 6000 platform. A panel-based analysis was first performed using a gene panel consisting of 2,864 genes associated with inflammatory response, connective tissue abnormalities, immunodeficiency, and autoimmunity to identify shared clinically relevant variants between affected relatives. In families where no shared candidate variants were identified, an unbiased gene-prioritization analysis was applied to explore additional genetic contributors. The panel-based analysis identified shared candidate variants in 8 of the 26 families, yielding a detection rate of 30.77%. Among these, three families shared pathogenic or likely pathogenic (P/LP) variants; an additional two families were identified through the unbiased gene prioritization analysis. The identified variants (2 P, 4 LP, 16 VUS plausibly pathogenic, and 5 VUS) affected genes involved in immune signaling, inflammatory recognition, antigen processing, apoptosis, and connective tissue integrity. Most variants identified in families with shared candidate variants had an autosomal dominant form of inheritance. Thirteen out of the 27 candidate variants (48.15%) were not found in ClinVar or reported in literature. 5 Overall, these findings support a clear genetic contribution to UCTD and demonstrate the effectiveness of using family based WGS approaches for investigating complex autoimmune diseases. By integrating both genomic and segregation data, this study investigates the mutational spectrum associated with UCTD and highlights the importance of family-based approaches for improving variant interpretation and reducing diagnostic uncertainty

Le connettiviti (CTD) sono un gruppo eterogeneo di malattie autoimmuni sistemiche caratterizzate da infiammazione cronica dei tessuti connettivi, disregolazione immunitaria e potenziale coinvolgimento di più organi. Queste malattie sono comunemente associate alla presenza di autoanticorpi, inclusi gli anticorpi antinucleo (ANA), che indicano un'autoimmunità sistemica. La connettivite indifferenziata (UCTD) descrive individui affetti che mostrano caratteristiche cliniche e sierologiche di autoimmunità sistemica ma non soddisfano i requisiti di classificazione per una CTD definita. Sebbene l'UCTD sia spesso considerata meno grave, circa un terzo dei pazienti progredisce verso una CTD definita entro i primi cinque anni dall'insorgenza della malattia. Mentre è noto che i fattori genetici contribuiscono alla suscettibilità in molte CTD, la base genetica dell'UCTD rimane ancora poco chiara. Tuttavia, i progressi nel sequenziamento dell'intero genoma (WGS) consentono di individuare varianti rare associate a malattia. In questo studio, abbiamo esaminato il background genetico di 52 individui affetti provenienti da 26 famiglie non imparentate di origine italiana, tutti con diagnosi di UCTD o di una CTD definita, utilizzando un approccio WGS basato sul sequenziamento di più familiari affetti. Il DNA genomico è stato estratto da campioni di sangue periferico e sequenziato utilizzando la piattaforma Illumina NovaSeq 6000. È stata prima eseguita un'analisi basata su un pannello di 2,864 geni associati alla risposta infiammatoria, alle anomalie del tessuto connettivo, all'immunodeficienza e all'autoimmunità, al fine di identificare varianti clinicamente rilevanti condivise tra i familiari affetti. Nelle famiglie in cui non sono state identificate varianti candidate condivise, è stata applicata un'analisi imparziale di prioritizzazione dei geni per esplorare ulteriori fattori genetici contributivi. L'analisi basata su pannello ha identificato varianti candidate condivise in 8 delle 26 famiglie, con una resa diagnostica complessiva del 30,77%. Tra queste, tre famiglie condividevano varianti patogenetiche o probabilmente patogenetiche (P/LP); altre due famiglie sono state identificate attraverso l'analisi di prioritizzazione genica. Le varianti identificate (2 P, 4 LP, 16 VUS probabilmente patogenetiche, e 5 VUS) coinvolgono geni associati alla segnalazione immunitaria, all’ infiammazione, al riconoscimento degli antigeni, nell'apoptosi e nell'integrità del tessuto connettivo. La maggior parte delle varianti identificate nelle famiglie con varianti candidate 7 condivise aveva una forma di eredità autosomica dominante. Tredici delle 27 varianti candidate (48,15%) non erano riportate nè in ClinVar né in letteratura. Nel complesso, questi risultati supportano un contributo genetico all'UCTD e dimostrano l'efficacia dell'uso di approcci WGS basati sull’analisi di più familiari affetti per lo studio di malattie autoimmuni complesse. Integrando sia i dati genomici che quelli di segregazione, questo studio indaga lo spettro mutazionale associato all'UCTD e sottolinea l'importanza degli studi famigliari per migliorare l'interpretazione delle varianti e ridurre l'incertezza diagnostica.