STUDIO DEL MECCANISMO ALLA BASE DI PKM2 E PKM1 NELLE CELLULE CORTICALI NERVOSE IN CONDIZIONE DI ISCHEMIA

Ischemic stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide and is characterized by profound alterations in cerebral energy metabolism. Neurons and astrocytes display different vulnerability to ischemia, attributable to their distinct bioenergetic characteristics and to differential expression profiles of the pyruvate kinase isoforms PKM1 and PKM2. PKM1, which has high catalytic activity, supports oxidative phosphorylation typical of neurons, whereas PKM2, a more dynamic isoform regulated by stress signals, is predominantly expressed in astrocytes and exerts non-canonical functions in transcriptional regulation and inflammatory responses. The aim of this study was to analyze how oxygen and glucose deprivation (OGD), an in vitro model of cerebral ischemia, affects cellular metabolism, survival, and regulation of PKM1/PKM2 isoforms in cultured murine neurons and astrocytes. To this end, mitochondrial parameters were assessed using the Seahorse Mito Stress Test (OCR, basal and maximal respiration, ATP-linked respiration, and spare respiratory capacity), cell death was evaluated by Annexin V/7-AAD assay, caspase-3 activity was measured, and PKM1/PKM2 expression was analyzed by Western blot, RT-qPCR, and immunocytochemistry. Neurons exhibited a marked reduction in mitochondrial function as early as 30 minutes of OGD, with a strong decrease in basal and maximal respiration and a significant increase in apoptosis and caspase-3 activity. PKM2 was the isoform most strongly modulated in response to ischemic stress, whereas PKM1 remained relatively stable. In contrast, astrocytes showed greater metabolic resilience: the reduction in OCR was more moderate, a compensatory increase in non-mitochondrial respiration and ATP production emerged after prolonged OGD, and the percentage of apoptotic cells remained lower than in neurons. In astrocytes, PKM1 displayed dynamic modulation, with a transient increase at 60 minutes of OGD, while PKM2 showed a tendency toward subcellular redistribution, suggesting possible nuclear regulatory functions. Overall, these results indicate that neurons and astrocytes adopt profoundly different metabolic strategies under ischemic conditions, and that PKM1 and PKM2 isoforms contribute differently to neuronal vulnerability and astrocytic resilience. Specific modulation of pyruvate kinase isoforms may represent a potential therapeutic target for neuroprotective interventions aimed at preserving bioenergetics and reducing cell death after ischemic stroke.

L’ictus ischemico è una delle principali cause di mortalità e disabilità a livello globale e si caratterizza per una profonda alterazione del metabolismo energetico cerebrale. Neuroni e astrociti mostrano una vulnerabilità diversa all’ischemia, attribuibile alle loro distinte caratteristiche bioenergetiche e ai differenti profili di espressione delle isoforme della piruvato chinasi PKM1 e PKM2. PKM1, ad attività catalitica elevata, sostiene la fosforilazione ossidativa tipica dei neuroni, mentre PKM2, più dinamica e regolata da segnali di stress, è principalmente espressa negli astrociti e possiede funzioni non canoniche di regolazione trascrizionale e risposta infiammatoria. Lo scopo del presente lavoro è stato analizzare come la deprivazione di ossigeno e glucosio (OGD), modello in vitro di ischemia cerebrale, modifichi il metabolismo cellulare, la sopravvivenza e la regolazione delle isoforme PKM1/PKM2 in neuroni e astrociti murini in coltura. Per questo sono stati valutati: i parametri mitocondriali tramite Seahorse Mito Stress Test (OCR, respirazione basale, massimale, ATP-linked e spare respiratory capacity), la morte cellulare mediante saggio Annexin V/7-AAD, l’attività della caspasi-3, e l’espressione di PKM1/PKM2 tramite Western Blot, RT-qPCR e immunocitochimica. I neuroni mostrano una marcata riduzione della funzionalità mitocondriale già dopo 30 minuti di OGD, con un forte calo della respirazione basale e massimale e un aumento significativo dell’apoptosi e dell’attività della caspasi-3. PKM2 risulta l’isoforma maggiormente modulata in risposta allo stress ischemico, mentre PKM1 rimane più stabile. Al contrario, gli astrociti mostrano una maggiore resilienza metabolica: la riduzione dell’OCR è più moderata, emerge un incremento compensatorio della respirazione non mitocondriale e della produzione di ATP dopo OGD prolungato, e la percentuale di cellule apoptotiche rimane inferiore rispetto ai neuroni. In questi ultimi, PKM1 presenta una modulazione dinamica, con un aumento transitorio a 60’ di OGD, mentre PKM2 mostra una tendenza alla redistribuzione subcellulare, suggerendo possibili funzioni regolatorie nucleari. Nel complesso, i risultati indicano che neuroni e astrociti adottano strategie metaboliche profondamente differenti in condizioni ischemiche, e che le isoforme PKM1 e PKM2 contribuiscono in modo distinto alla vulnerabilità neuronale e alla resilienza astrocitaria. La modulazione specifica delle isoforme della piruvato chinasi potrebbe rappresentare un potenziale target terapeutico per interventi neuroprotettivi mirati al mantenimento della bioenergetica e alla riduzione della morte cellulare dopo ictus ischemico.