Definizione di un protocollo per la generazione di organoidi cerebrali corticali per studiare neuroni corticali di proiezione: un’analisi qualitativa

Human brain organoids represent a promising model to study brain’s biological processes, as they provide a three-dimensional environment that closely resembles human brain tissue while bypassing many of the ethical and technical limitations associated with studies of the developing brain. Notably, organoids have proven to be an effective model for the study of pathologies and neurodevelopmental disorders (NDDs). However, cortical malformations are a prevalent feature in these, and unguided brain organoid protocols do not successfully recapitulate cortical processes. In this study, I successfully stablished the generation of cortical-guided brain organoids (CORT) by adapting and optimizing a protocol developed by Velasco et al., 2019, and compared it to an stablished unguided protocol (LANC) developed by Lancaster et al., 2013, to meet the specific requirements of our laboratory. Phenotypic characterization of both protocols revealed the presence of ventricular zone like structures populated by neural progenitors undergoing symmetric and asymmetric proliferation, and neuron migration, thereby successfully recapitulating key features of early human brain development. Unlike LANC, CORT organoids showed robust and homogeneous expression of dorsal and anterior progenitor markers, including EMX1 and PAX6, as well as cortical projection neuron markers CTIP2 and SATB2, indicating early laminar specification. Moreover, CORT organoids exhibited an increased RNA expression of genes involved in dorsal fate determination such as EMX1 and OTX2, alongside strong repression of ventral markers, including DLX2 and GBX2. In contrast, LANC organoids displayed greater regional heterogeneity and higher expression of ventral markers. Overall, these findings provide preliminary evidence for the successful generation of cortical organoids with dorsal telencephalic identity and early projection neurons specification. This work establishes an experimental platform for future investigations of cortical development in healthy and NDDs-related contexts.

Gli organoidi cerebrali umani rappresentano un modello promettente per lo studio dei processi biologici del cervello, in quanto forniscono un ambiente tridimensionale che riproduce in modo fedele il tessuto cerebrale umano, consentendo al contempo di superare molte delle limitazioni etiche e tecniche associate agli studi sul cervello durante lo sviluppo. In particolare, gli organoidi si sono dimostrati un modello efficace per l’analisi di patologie e di disturbi del neurosviluppo (NDDs). Tuttavia, le malformazioni corticali costituiscono una caratteristica ricorrente in tali condizioni e i protocolli di generazione di organoidi cerebrali non guidati non riescono a ricapitolare adeguatamente i processi di sviluppo della corteccia. Nel presente studio è stata stabilita con successo la generazione di organoidi cerebrali guidati verso identità corticale (CORT) mediante l’adattamento e l’ottimizzazione di un protocollo precedentemente sviluppato da Velasco et al. (2019), successivamente confrontato con un protocollo non guidato già consolidato (LANC), sviluppato da Lancaster et al. (2013), al fine di soddisfare le specifiche esigenze del nostro laboratorio. La caratterizzazione fenotipica di entrambi i protocolli ha rivelato la presenza di strutture analoghe alla zona ventricolare, popolate da progenitori neurali in proliferazione sia simmetrica sia asimmetrica, nonché fenomeni di migrazione neuronale, ricapitolando con successo alcune caratteristiche chiave delle fasi precoci dello sviluppo cerebrale umano. A differenza degli organoidi LANC, gli organoidi CORT hanno mostrato un’espressione robusta e omogenea di marcatori dei progenitori dorsali e anteriori, tra cui EMX1 e PAX6, nonché dei marcatori dei neuroni di proiezione corticali CTIP2 e SATB2, indicativi di una precoce specificazione laminare. Inoltre, gli organoidi CORT hanno evidenziato un aumento dell’espressione di RNA di geni coinvolti nella determinazione del destino dorsale, quali EMX1 e OTX2, accompagnato da una marcata repressione dei marcatori ventrali, tra cui DLX2 e GBX2. Al contrario, gli organoidi LANC hanno mostrato una maggiore eterogeneità regionale e livelli più elevati di espressione di marcatori ventrali. Nel complesso, questi risultati forniscono evidenze preliminari della riuscita generazione di organoidi corticali caratterizzati da un’identità telencefalica dorsale e da una precoce specificazione dei neuroni di proiezione. Il presente lavoro stabilisce una piattaforma sperimentale per future indagini sullo sviluppo corticale sia in condizioni fisiologiche sia nel contesto dei disturbi del neurosviluppo.