Effetti delle microvescicole derivate dalle piastrine durante l'invecchiamento: studio di immunofluorescenza in vitro della proliferazione e della senescenza in NHDF

Aging significantly impacts human health, particularly affecting the skin, the body's largest organ. Intrinsic and extrinsic factors lead to cellular aging, resulting in the accumulation of senescent markers and a decline in healthy cells, worsening age-related diseases. Key to this process are fibroblast cells in the skin, which face age-related impairments in proliferation and extracellular matrix production, influencing wound healing, fibrosis, and cancer progression. Extracellular vesicles (EVs), including platelet-derived microvesicles (PMVs), are crucial for intercellular communication, transporting key biomolecules and promoting fibroblast activity. Recent studies emphasize the dual roles of EVs in aging and their potential applications in therapies and diagnostics for age-related diseases. Thus, to clarify the functional role of PMVs in fibroblast cellular aging, in the present thesis work I investigated the potential pro- or anti-aging effects of different doses (1μg/ml, 10μg/ml and 30μg/ml) of adult human blood thrombin-induced PMVs in an in vitro normal human dermal fibroblast (NHDF) aging model. After 24h treatment with different doses of PMVs, the young and old NHDF cells were subjected to viability evaluation, performed using a 3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay, and a subsequent morphological analysis, using phase contrast microscopy. The PMV potential pro- or anti-aging effect on NHDF proliferation, senescence, cell organelles and oxidative stress has been finally evaluated by immunofluorescence assay, focusing on the expression levels of specific markers (Ki-67, PCNA, p53, p16, mitochondria, cytoskeletal α-tubulin and SOD1). The collected results demonstrate that PMVs may activate aged fibroblasts by modulating all the evaluated NHDF cellular aging phenotypes in a dose-dependent manner. The MTT assay revealed a lower viability deviation of PMV-treated old NHDF cells compared to that of the young. Using phase contrast microscopy evaluation, I observed a senescence morphology maintenance and enhancement of the cell area in the older cells by the PMV medium and higher doses. The immunofluorescence analysis demonstrated an anti-aging effect on senescent NHDF cells only at the lower PMV dose through an increase in the expression of pro-proliferative markers (Ki-67, PCNA), reduction in the senescence marker expression (p53, p16), elevated cell organelle content (mitochondria, cytoskeletal α-tubulin) and enhanced antioxidant levels (SOD1). However, higher PMV doses diminished these anti-aging effects, highlighting the complex dose-response relationship in aged fibroblasts. This study has some limitations, including the lack of characterization of the isolated PMVs and the potential variability compared with previous studies, highlighting the need for standardized methodologies in future investigations. Further research should also explore additional aging markers and clarify the role of PMVs in fibroblast differentiation and inflammation. Despite these limitations, our findings suggest that PMVs may represent a potential therapeutic target for mitigating aging-related effects and improving regenerative outcomes in age-related diseases such as chronic wound healing, fibrosis, and cancer.

L’invecchiamento ha un impatto significativo sulla salute umana, interessando in particolare la pelle, il più grande organo del corpo. Fattori intrinseci ed estrinseci determinano l’invecchiamento cellulare, con conseguente accumulo di marcatori di senescenza e riduzione delle cellule sane, aggravando le patologie correlate all’età. Un ruolo chiave in questo processo è svolto dai fibroblasti cutanei, che con l’avanzare dell’età presentano alterazioni nella proliferazione e nella produzione di matrice extracellulare, influenzando processi quali la guarigione delle ferite, la fibrosi e la progressione tumorale. Le vescicole extracellulari (EVs), incluse le microvescicole derivate dalle piastrine (PMVs), sono fondamentali per la comunicazione intercellulare, poiché trasportano importanti biomolecole e promuovono l’attività dei fibroblasti. Studi recenti evidenziano il duplice ruolo delle EVs nell’invecchiamento e il loro potenziale utilizzo in ambito terapeutico e diagnostico per le malattie correlate all’età. Pertanto, al fine di chiarire il ruolo funzionale delle PMVs nell’invecchiamento cellulare dei fibroblasti, nel presente lavoro di tesi ho investigato i potenziali effetti pro- o anti-invecchiamento di diverse dosi (1 μg/ml, 10 μg/ml e 30 μg/ml) di PMVs indotte da trombina ottenute da sangue umano adulto in un modello in vitro di invecchiamento utilizzando fibroblasti del derma umani normali (NHDF). Dopo 24 ore di trattamento con diverse dosi di PMVs, le cellule NHDF giovani e anziane sono state sottoposte alla valutazione della vitalità mediante saggio MTT e alla successiva analisi della morfologia mediante microscopia a contrasto di fase. I potenziali effetti pro- o anti-invecchiamento delle PMVs sulla proliferazione degli NHDF, sulla senescenza, sull’integrità degli organelli e sullo stress ossidativo sono stati infine valutati mediante saggio di immunofluorescenza, concentrandosi sui livelli di espressione di specifici marcatori (Ki-67, PCNA, p53, p16, mitocondri, α-tubulina del citoscheletro e SOD1). I risultati ottenuti dimostrano che le PMVs possono attivare i fibroblasti invecchiati modulando tutti i fenotipi cellulari di invecchiamento degli NHDF valutati in maniera dose-dipendente. Il saggio MTT ha evidenziato una minore deviazione della vitalità nelle cellule NHDF anziane trattate con PMVs rispetto a quella osservata nelle cellule giovani. Attraverso la valutazione mediante microscopia a contrasto di fase, ho osservato il mantenimento della morfologia senescente e un aumento dell’area cellulare nelle cellule anziane trattate con dosi medie e alte di PMVs. L’analisi in immunofluorescenza ha invece evidenziato un effetto anti-invecchiamento sulle cellule NHDF senescenti solo alla dose più bassa di PMVs, con un aumento dell’espressione di marcatori pro-proliferativi (Ki-67, PCNA), una riduzione dei marcatori di senescenza (p53, p16), un incremento del contenuto di organelli cellulari (mitocondri, α-tubulina del citoscheletro) e un aumento dei livelli di antiossidanti (SOD1). Tuttavia, dosi più elevate di PMVs hanno attenuato questi effetti anti-invecchiamento, evidenziando la complessa relazione dose-risposta nei fibroblasti invecchiati. Questo studio presenta alcune limitazioni, tra cui la mancata caratterizzazione delle PMVs isolate e la potenziale variabilità rispetto a studi precedenti, evidenziando la necessità di metodologie standardizzate nelle future indagini. Ulteriori ricerche dovrebbero inoltre esplorare ulteriori marcatori di invecchiamento e chiarire il ruolo delle PMVs nella differenziazione dei fibroblasti e nell’infiammazione. Nonostante queste limitazioni, i nostri risultati suggeriscono che le PMVs possano rappresentare un potenziale bersaglio terapeutico per mitigare gli effetti legati all’invecchiamento e migliorare gli esiti rigenerativi nelle patologie correlate all’età, come la guarigione cronica delle ferite, la fibrosi e il cancro.