Indagine sulla risposta al trattamento con L-Asparaginasi in RS4; 11 cellule come modello in vitro della leucemia linfoblastica acuta: nuove intuizioni dai dati scRNA-seq validate con misurazioni di citometria a flusso

Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most common pediatric malignancy, and L-asparaginase represents a cornerstone of its therapeutic regimen due to its ability to disrupt leukemic cell metabolism. Despite its clinical efficacy, the cellular mechanisms underlying heterogeneous responses and the emergence of resistant subpopulations remain incompletely understood. The aim of this study was to investigate the molecular and functional response to L-asparaginase treatment using the RS4;11 cell line as an in-vitro model of ALL[CR2.1]. This work originated from a collaboration between the Radiation Biophysics and Radiobiology group of the “A. Volta” Physics Department and the Immunology and General pathology group of the Department of Molecular Medicine (Prof. M. Maggi and C. Scotti), University of Pavia. To dissect the transcriptional heterogeneity associated with drug exposure, a single-cell RNA sequencing approach was employed. This high-resolution analysis enabled the identification of transcriptional states and rare cellular subpopulations emerging during treatment. Transcriptomic findings were experimentally validated through flow-cytometry and immunofluorescence assays to monitor key regulators of cell cycle progression and proliferation. The results revealed that L-asparaginase treatment induces a profound proliferative arrest accompanied by the activation of cell-cycle checkpoints. Multiple cell death pathways were observed to be activated, including apoptosis and potentially ferroptosis, together with the emergence of therapy-induced cellular senescence. Importantly, single-cell analysis highlighted a heterogeneous cellular response: while the majority of cells succumbed to metabolic stress, a subset displayed transcriptional plasticity suggestive of adaptive resistance mechanisms. At the molecular level, key biomarkers were identified, including the upregulation of the cyclin-dependent kinase inhibitor p21 (CDKN1A) and the marked repression of proliferation-associated markers such as FOXM1 and Ki-67, confirming the establishment of a strong proliferative blockade. Overall, these findings indicate that the antileukemic activity of L-asparaginase extends beyond simple biosynthetic deprivation and involves a systemic rewiring of cellular regulatory networks. This work provides new insights into the mechanisms underlying treatment response and highlights potential therapeutic opportunities for combination strategies aimed at targeting resistant leukemic subpopulations.

La leucemia linfoblastica acuta (ALL) rappresenta la neoplasia pediatrica più comune e la L-Asparaginasi costituisce uno dei farmaci cardine della sua terapia grazie alla capacità di alterare il metabolismo delle cellule leucemiche. Nonostante la sua comprovata efficacia clinica, i meccanismi cellulari alla base delle risposte eterogenee al trattamento e dell’emergere di sottopopolazioni resistenti non sono ancora completamente chiariti. L’obiettivo di questo studio è stato quello di indagare la risposta molecolare e funzionale al trattamento con L-Asparaginasi utilizzando la linea cellulare RS4;11 come modello in vitro di ALL. Questo lavoro ha avuto origine da una collaborazione tra il gruppo di Biofisica delle Radiazioni e Radiobiologia del Dipartimento di Fisica "A. Volta" e il gruppo di Immunologia e Patologia Generale del Dipartimento di Medicina Molecolare (Prof. M. Maggi e C. Scotti), Università di Pavia. Per analizzare l’eterogeneità trascrizionale associata all’esposizione al farmaco è stato adottato un approccio basato sul sequenziamento dell’RNA a singola cellula. Questa analisi ad alta risoluzione ha permesso di identificare diversi stati trascrizionali e rare sottopopolazioni cellulari emergenti durante il trattamento. I risultati trascrittomici sono stati successivamente validati sperimentalmente mediante citometria a flusso e saggi di immunofluorescenza, utilizzati per monitorare i principali regolatori del ciclo cellulare e della proliferazione. I risultati hanno evidenziato che il trattamento con L-Asparaginasi induce un marcato arresto proliferativo accompagnato dall’attivazione dei checkpoint del ciclo cellulare. Sono inoltre state osservate l’attivazione di molteplici vie di morte cellulare, tra cui apoptosi e potenzialmente ferroptosi, insieme all’emergere di uno stato di senescenza cellulare indotta dalla terapia. L’analisi a singola cellula ha messo in luce una risposta cellulare eterogenea: mentre la maggior parte delle cellule soccombe allo stress metabolico, una sottopopolazione mostra una significativa plasticità trascrizionale, suggerendo l’attivazione di possibili meccanismi di resistenza adattativa. A livello molecolare sono stati identificati biomarcatori chiave, tra cui l’up-regolazione dell’inibitore delle chinasi ciclina-dipendenti p21 (CDKN1A) e la marcata repressione dei marcatori proliferativi FOXM1 e Ki-67, confermando l’instaurarsi di un forte blocco proliferativo. Nel complesso, questi risultati indicano che l’attività antileucemica della L-Asparaginasi non deriva esclusivamente dalla deprivazione biosintetica, ma coinvolge una riprogrammazione sistemica delle reti regolatorie cellulari. Questo studio fornisce nuove informazioni sui meccanismi alla base della risposta al trattamento e suggerisce potenziali opportunità terapeutiche per strategie combinate mirate a colpire specifiche sottopopolazioni leucemiche resistenti.