Strain improvement di Streptomyces Kanamyceticus per incrementare la produzione di kanamicina

The genus Streptomyces comprises filamentous Gram-positive bacteria widely distributed in soil and known for their ability to produce numerous bioactive secondary metabolites, including more than 60% of the natural antibiotics used in clinical practice. Among these, kanamycin is an aminoglycoside antibiotic produced by Streptomyces kanamyceticus, characterized by antibacterial activity against numerous Gram-negative bacteria and some Gram-positive bacteria and by a mechanism of action based on binding to the 30S subunit of the bacterial ribosome. Despite its widespread use, the optimization of production processes remains an important objective, and the development of strain improvement strategies represents one of the most effective approaches for increasing fermentation yield. The aim of this thesis was to investigate and improve kanamycin production in S. kanamyceticus through an experimental approach based on random mutagenesis induced by ultraviolet (UV) radiation and the subsequent screening of isolates potentially characterized by higher production capacity. Starting from a strain of S. kanamyceticus preserved in the strain collection of ACS Dobfar S.p.A., single colonies were isolated in order to obtain distinct cell lines. The different isolates were then subjected to shake-flask fermentation tests, which revealed differences in production capacity. A cell line characterized by higher kanamycin production was identified. Spores of the selected strain were then exposed to UV radiation in order to induce random mutations in the genome and generate a population of mutants potentially capable of even higher production. Following the mutagenic treatment, the derived strains were isolated and subjected to a process of selection and characterization. The antimicrobial activity of the different isolates was evaluated through a multiple-screening approach combining microbiological assays and complementary analytical techniques. In particular, microplate assays based on spectrophotometric measurement of bacterial growth were performed, allowing a quantitative estimation of the antimicrobial activity of fermentation samples. For a more accurate characterization of fermentation products, kanamycin was also analyzed by high-performance liquid chromatography (HPLC). The integration of microbiological and analytical methods allowed a more comprehensive evaluation of kanamycin production in the different strains analyzed. The results revealed significant variability in production capacity among the isolates derived from the mutagenic treatment. In particular, some strains showed a marked reduction, up to an almost complete loss, of antibiotic production, whereas others exhibited higher antimicrobial activity compared with the parental strain, suggesting that UV radiation treatment promoted the occurrence of mutations capable of influencing kanamycin production. This result was verified by scaling up the fermentation process in a 20-L pilot plant. The concentration of kanamycin produced by isolate number 51, derived from UV treatment, was higher than that produced by the parental strain. Overall, this study confirmed the potential of mutagenesis and selection strategies as tools for improving producing strains. The integration of these approaches with microbiological techniques provides a solid basis for the development of more efficient production processes and for the industrial use of microorganisms producing secondary metabolites.

Il genere Streptomyces comprende batteri filamentosi Gram-positivi diffusi nel suolo e noti per la loro capacità di produrre numerosi metaboliti secondari bioattivi, tra cui oltre il 60% degli antibiotici naturali utilizzati in ambito clinico. Tra questi, la kanamicina è un antibiotico aminoglicosidico prodotto da Streptomyces kanamyceticus, caratterizzato da attività antibatterica nei confronti di numerosi batteri Gram-negativi e di alcuni Gram-positivi e da un meccanismo d’azione basato sul legame con la subunità 30S del ribosoma batterico. Nonostante il suo ampio utilizzo, l’ottimizzazione dei processi produttivi rimane un obiettivo rilevante, e lo sviluppo di strategie di strain improvement rappresenta uno degli approcci più efficaci per incrementare la resa fermentativa. Il presente lavoro di tesi ha avuto come obiettivo lo studio e il miglioramento della produzione di kanamicina in S. kanamyceticus attraverso un approccio sperimentale basato sulla mutagenesi casuale indotta da radiazioni ultraviolette (UV) e sul successivo screening di isolati eventualmente caratterizzati da una maggiore capacità produttiva. A partire da un ceppo di S. kanamyceticus conservato nella ceppoteca di ACS Dobfar S.p.A. sono state isolate colonie singole al fine di ottenere linee cellulari distinte. I diversi isolati sono stati quindi sottoposti a test di fermentazione in beuta che hanno evidenziato differenze in termini di capacità produttiva. È stata identificata una linea cellulare caratterizzata da una maggiore produzione di kanamicina. Le spore del ceppo selezionato sono state quindi sottoposte a trattamento con radiazioni UV allo scopo di indurre mutazioni casuali nel genoma e generare una popolazione di mutanti potenzialmente ancora più produttivi. Dopo il trattamento mutageno, i ceppi derivati sono stati isolati e sottoposti a un processo di selezione e caratterizzazione. La valutazione dell’attività antimicrobica dei diversi isolati è stata effettuata mediante un approccio di screening multiplo che ha combinato saggi microbiologici e tecniche analitiche complementari. In particolare, sono stati eseguiti test in micropiastra basati sulla misurazione spettrofotometrica della crescita batterica, che hanno consentito una stima quantitativa dell’attività antimicrobica dei campioni di fermentazione. Per una caratterizzazione più accurata dei prodotti fermentativi, la kanamicina è stata inoltre analizzata mediante HPLC. L’integrazione di metodi microbiologici e analitici ha permesso di ottenere una valutazione più completa della produzione di kanamicina nei diversi ceppi analizzati. I risultati ottenuti hanno evidenziato una significativa variabilità nella capacità produttiva tra gli isolati derivati dal trattamento mutageno. In particolare, alcuni ceppi hanno evidenziato una marcata riduzione, fino quasi all’annullamento, della produzione dell’antibiotico, mentre altri hanno mostrato un’attività antimicrobica maggiore rispetto a quella del ceppo parentale; ciò suggerisce che il trattamento con radiazioni UV abbia favorito l’insorgenza di mutazioni in grado di influenzare la produzione di kanamicina. Questo risultato è stato verificato mediante scale-up del processo fermentativo in un impianto pilota da 20 L. La concentrazione di kanamicina prodotta dall’isolato numero 51, derivante da trattamento UV, è risultata maggiore di quella prodotta dal ceppo parentale. Nel complesso, il presente studio ha confermato il potenziale delle strategie di mutagenesi e selezione come strumenti per il miglioramento dei ceppi produttori. L’integrazione di tali approcci con tecniche microbiologiche rappresenta una base solida per lo sviluppo di processi produttivi più efficienti e per l’impiego industriale dei microrganismi produttori di metaboliti secondari.