Vescicole Extracellulari da cellule mesenchimali ad alto contenuto di ATP: strategia emergente di drug delivery in modelli in vitro di ischemia renale

Introduction In recent years, extracellular vesicles (EVs) have emerged as promising and innovative tools for drug delivery, offering a wide range of potential applications that may significantly improve patient care and clinical outcomes of diseases. We previously demonstrated, for the first time, the direct delivery of ATP into renal tubular cells in vitro using porcine mesenchymal stromal cell–derived EVs as carriers. Under conditions of chemical ischemia, this approach effectively restored intracellular ATP levels, preserved cell viability, and reduced the expression of apoptotic genes (BCL2/BAX ratio). Aim This study aimed to evaluate different methods for loading ATP into human EVs, validate these EVs as ATP carriers, and assess their efficacy in an in vitro model of hypoxic injury using HK2 renal tubular cells. Methods Different loading techniques, including microfluidics, electroporation, and freeze–thaw cycles, were compared to assess both ATP loading efficiency into human EVs and ATP release into the extracellular environment at 37 °C over 4 h. Intravesicular and released ATP levels were quantified using ELISA kits. A hypoxic injury model was validated by performing kinetic analysis of lactate dehydrogenase (LDH) release from HK2 cells. After defining the optimal treatment timing, the cells were assigned to five experimental groups: CTRL+ (cells cultured in complete medium), IP (cells exposed to hypoxia in low-glucose DMEM), EV, EV-ATP, or ATP (HK2 cells exposed to hypoxia in low-glucose DMEM with the addition of naive EVs, ATP-loaded EVs, or free ATP). Cell viability after 8 h of hypoxia was assessed using trypan blue exclusion and lactate dehydrogenase (LDH) release in the supernatant. Extracellular electrolyte concentrations (Na⁺, K⁺) were also measured. Results Naïve human EVs lacked detectable levels of ATP. Among the tested methods tested, microfluidics and electroporation showed comparable ATP loading efficiencies (p < 0,001), whereas freeze–thaw cycles were ineffective. However, electroporation was selected for downstream testing due to superior ATP retention over 4 h at 37°C. A kinetic analysis of LDH release from hypoxic HK2 cells revealed the first significant increase at 3 h of hypoxia; therefore this time point was defined as the optimal timing for treatment administration (EV, EV-ATP, or ATP). Under hypoxic conditions, cell viability was preserved only in HK2 cells treated with EV-ATP, reaching levels comparable to non-hypoxic controls. All treatments resulted in reduced LDH levels in the supernatant; only EV-ATP treatment resulted in an increased extracellular Na⁺/K⁺ ratio. Conclusion Electroporation emerged as the optimal loading strategy, demonstrating superior ATP retention compared with microfluidics and freeze–thaw cycles. Importantly, treatment with these ATP-loaded EVs significantly preserved renal tubular cell viability during hypoxia and uniquely modulated extracellular Na⁺/K⁺, highlighting their potential to restore cellular bioenergetics and ionic homeostasis in ischemic settings.

Introduzione Negli ultimi anni, le vescicole extracellulari (EV) si sono affermate come strumenti promettenti e innovativi per la somministrazione di farmaci, offrendo un'ampia gamma di potenziali applicazioni che potrebbero migliorare significativamente la cura dei pazienti e gli esiti clinici delle malattie. In precedenza, abbiamo dimostrato per la prima volta la somministrazione diretta di ATP in cellule tubulari renali in vitro utilizzando EV derivate da cellule stromali mesenchimali suine come vettori. In condizioni di ischemia chimica, questo approccio ha ripristinato efficacemente i livelli intracellulari di ATP, preservato la vitalità cellulare e ridotto l'espressione dei geni apoptotici (rapporto BCL2/BAX). Obiettivo Questo studio si propone di valutare diversi metodi per il caricamento di ATP nelle vescicole extracellulari umane (EV), di validare queste EV come vettori di ATP e di valutarne l'efficacia in un modello in vitro di danno ipossico utilizzando cellule tubulari renali HK2. Metodi Diverse tecniche di caricamento, tra cui microfluidica, elettroporazione e cicli di congelamento-scongelamento, sono state confrontate per valutare sia l'efficienza di caricamento dell'ATP nelle EV umane sia il rilascio di ATP nell'ambiente extracellulare a 37°C per 4 ore. I livelli di ATP intravescicolare e rilasciato sono stati quantificati mediante kit ELISA. Un modello di danno ipossico è stato validato mediante analisi cinetica del rilascio di lattato deidrogenasi (LDH) dalle cellule HK2. Dopo aver definito la tempistica ottimale del trattamento, le cellule sono state assegnate a cinque gruppi sperimentali: CTRL+ (cellule coltivate in terreno completo), IP (cellule esposte a ipossia in DMEM a basso contenuto di glucosio), EV, EV-ATP o ATP (cellule HK2 esposte a ipossia in DMEM a basso contenuto di glucosio con l'aggiunta di EV naive, EV caricate con ATP o ATP libero). La vitalità cellulare dopo 8 ore di ipossia è stata valutata mediante saggio in Trypan Blue e rilascio di lattato deidrogenasi (LDH) nel surnatante. Sono state misurate anche le concentrazioni di elettroliti extracellulari (Na⁺, K⁺). Risultati Le vescicole extracellulari umane non trattate non presentavano livelli rilevabili di ATP. Tra i metodi testati, la microfluidica e l'elettroporazione hanno mostrato efficienze di caricamento di ATP comparabili (p < 0,001), mentre i cicli di congelamento-scongelamento si sono rivelati inefficaci. Tuttavia, l'elettroporazione è stata selezionata per i test successivi grazie alla sua superiore ritenzione di ATP per oltre 4 ore a 37 °C. Un'analisi cinetica del rilascio di LDH da cellule HK2 ipossiche ha rivelato il primo aumento significativo dopo 3 ore di ipossia; pertanto, questo punto temporale è stato definito come il momento ottimale per la somministrazione del trattamento (EV, EV-ATP o ATP). In condizioni ipossiche, la vitalità cellulare è stata preservata solo nelle cellule HK2 trattate con EV-ATP, raggiungendo livelli paragonabili ai controlli non ipossici. Tutti i trattamenti hanno determinato una riduzione dei livelli di LDH nel surnatante e solo il trattamento con EV-ATP ha comportato un aumento del rapporto Na⁺/K⁺ extracellulare. Conclusione L'elettroporazione si è rivelata la strategia di caricamento ottimale, dimostrando una ritenzione di ATP superiore rispetto alla microfluidica e ai cicli di congelamento-scongelamento. È importante sottolineare che il trattamento con queste vescicole extracellulari caricate con ATP ha preservato significativamente la vitalità delle cellule tubulari renali durante l'ipossia e ha modulato in modo univoco il rapporto Na⁺/K⁺ extracellulare, evidenziando il loro potenziale nel ripristinare la bioenergetica cellulare e l'omeostasi ionica in contesti ischemici.