Espressione, purificazione e caratterizzazione del dominio C-terminale (a funzione sconosciuta) della vitellogenina A1 di Aedes albopictus

This work aimed to establish a reproducible strategy for the recombinant expression, purification, and structural characterization of the C-terminal domain of vitellogenin A1 (C-VgA1) from Aedes albopictus. While vitellogenin is known as the major yolk precursor protein essential for oocyte development, structural information at the level of individual domains remains limited. In particular, the function of C-terminal domain was never clearly determined, and the structural data are currently based only on computational predictions and sequence similarity. Addressing this gap is important for enabling future high-resolution structural studies and for supporting downstream investigations into domain-specific functions. To address this aim, the coding sequence of C-VgA1 was cloned into a pLEGO-01.01.021 expression vector as a His-SUMO fusion construct to enhance solubility and facilitate affinity-based protein purification. The construct was propagated in E. coli TOP10 cells and expressed in E. coli T7 Shuffle cells under optimized conditions. Following cell lysis and filtration, the soluble fraction was purified using immobilized metal affinity chromatography (IMAC) step on a Ni2+-charged HisTrap column. The His-SUMO-tag was subsequently removed by proteolytic cleavage, and a Reverse-IMAC step was performed to separate the cleaved, untagged protein from His-tagged species. Size exclusion chromatography (SEC) was used as a polishing step to assess homogeneity and oligomeric state. Purification steps were monitored by SDS-PAGE under reducing and non-reducing conditions. SDS-PAGE analysis confirmed enrichment of the His-tagged protein during IMAC and effective removal of the His-tag following proteolytic cleavage. Reverse-IMAC enabled separation of His-containing contaminants from the cleaved target protein. SEC analysis revealed a dominant, well-defined peak consistent with a monomeric, and gel analysis confirmed the presence of a predominantly homogeneous pure protein fraction. Comparison under reducing and non-reducing conditions did not indicate significant intermolecular disulfide bonds. Crystallization trials were conducted using sparse-matrix screening strategies to identify initial crystallization conditions. These efforts resulted in the formation of multiple crystals, that were ideal for structural determination, including a condition that yielded crystals diffracting to the detector limit. These findings establish a robust and reproducible purification and characterization workflow for the C-terminal domain of VgA1. The ability to obtain C-VgA1 in a soluble, monodisperse form is a critical prerequisite for high-resolution structural determination and mechanistic analysis. This is particularly relevant, considering that the structural data did not fully align with previously predicted computational models. This observation raised the possibility that the VgA1 C-terminal domain may adopt a novel or previously uncharacterized fold, limiting the ability to infer its function based solely on structural information. To address this limitation, an in vivo investigation strategy is being explored, and a GFP-tagged construct (His-GFP-C-VgA1) was therefore designed to enable tracking of the protein following injection in the insect model. Using this construct, we will investigate the cellular and tissue localization of the C-VgA1 construct, providing insights into its potential biological role.

Questo lavoro si proponeva di stabilire una strategia riproducibile per l'espressione ricombinante, la purificazione e la caratterizzazione strutturale del dominio C-terminale della vitellogenina A1 (C-VgA1) di Aedes albopictus. Sebbene la vitellogenina sia il principale precursore per lo sviluppo degli ovociti, le informazioni strutturali a livello dei singoli domini rimangono limitate. In particolare, la funzione del dominio C-terminale non è mai stata chiaramente determinata e i pochi dati strutturali attualmente disponibili si basano solo su previsioni computazionali e similarità di sequenza. Colmare questa lacuna è importante per consentire futuri studi strutturali ad alta risoluzione e per supportare indagini successive sulle funzioni specifiche dei domini. Per raggiungere questo obiettivo, la sequenza codificante di C-VgA1 è stata clonata in un vettore di espressione pLEGO-01.01.021 come costrutto di fusione His-SUMO per migliorarne la solubilità e facilitare la purificazione mediante cromatografia di affinità. Il costrutto è stato propagato in cellule di E. coli TOP10 ed espresso in cellule di E. coli T7 Shuffle in condizioni ottimizzate. Dopo la lisi cellulare e la filtrazione, la frazione solubile è stata purificata mediante cromatografia di affinità con metalli immobilizzati (IMAC) su una colonna HisTrap caricata con Ni2+. Il tag His-SUMO è stato successivamente rimosso tramite digestione proteolitica ed è stato eseguito un passaggio di IMAC inversa per separare la proteina digerita dalle specie con tag His-SUMO. La cromatografia di esclusione dimensionale (SEC) è stata utilizzata come fase di affinamento per valutare l'omogeneità e lo stato oligomerico. Le fasi di purificazione sono state monitorate mediante SDS-PAGE in condizioni riducenti e non riducenti. L'analisi SDS-PAGE ha confermato l'arricchimento della proteina con tag His durante l'IMAC e l'efficace rimozione del tag His-SUMO dopo la digestione proteolitica. L'IMAC inversa ha permesso la separazione dei contaminanti contenenti His dalla proteina target digerita. L'analisi SEC ha rivelato un picco dominante e ben definito, coerente con un monomero, e l'analisi su gel ha confermato la presenza di una frazione proteica pura prevalentemente omogenea. Il confronto in condizioni riducenti e non riducenti non ha indicato la presenza di legami disolfuro intermolecolari significativi. Sono stati condotti esperimenti di cristallizzazione utilizzando strategie di screening a matrice sparsa per identificare le condizioni iniziali di cristallizzazione. Questi sforzi hanno portato alla formazione di numerosi cristalli, ideali per la determinazione strutturale, inclusa una condizione che ha prodotto cristalli capaci di diffrangere i raggi X fino al limite del rivelatore; la determinazione strutturale è in corso. Questi risultati stabiliscono un flusso di lavoro robusto e riproducibile per la purificazione e la caratterizzazione del dominio C-terminale di VgA1. La capacità di ottenere C-VgA1 in forma solubile e monodispersa è un prerequisito fondamentale per la determinazione strutturale ad alta risoluzione e l'analisi funzionale. E’ importante sottolineare che i dati finora disponibili suggeriscono che il dominio C-terminale possa adottare una conformazione nuova o precedentemente non caratterizzata, limitando la capacità di inferirne la funzione basandosi esclusivamente su informazioni strutturali. Per ovviare a questa limitazione, è stata proposta una strategia in vivo. È stato quindi generato un costrutto marcato con GFP (His-GFP-C-VgA1) per consentire il tracciamento della proteina dopo l'iniezione nel modello di insetto. Questo approccio permetterà di studiare la localizzazione cellulare e tissutale del costrutto, fornendo informazioni preliminari sul suo potenziale ruolo biologico.