Studio preclinico sull'impatto del Prednisolone nell'Atrofia Muscolare Spinale

Background. Spinal muscular atrophy (SMA) is an autosomal recessive neuromuscular disease characterized by very early dysfunction and degeneration of α-motor neurons in the spinal cord and brainstem giving rise to progressive proximal muscle atrophy and weakness of limb, trunk, bulbar and respiratory muscles, leading to flaccid paralysis and death by respiratory failure in the most severe forms. The disease results from homozygous deletion or gene conversion events in the Survival Motor Neuron 1 (SMN1) gene leading to reduced amounts of SMN protein, essential for mRNA splicing and maturation. This leads to system-wide dysfunctions, with motor neurons and muscle fibers being predominantly involved. Three therapies have been approved in the last decade, each one carrying shortcomings and turned out to be insufficient in completely cure SMA. Hence, the need for secondary therapies, even coupled with the approved ones, to improve the therapeutic effects is mandatory. The synthetic glucocorticoid Prednisolone is one of the drugs that lately received attention as a promising secondary therapy. Results. We tested the drug Prednisolone both in vitro, on NSC-34 motor neuron-like cells, on patient-derived fibroblasts and on motor neurons from patient-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs); and in vivo, in the SMNΔ7 mouse model of SMA. Our in vitro data show that Prednisolone was able to increase the transcription of the SMN1 paralogue gene SMN2 in patient-derived fibroblasts and to influence the subcellular localization of SMN in the NSC-34 cells. Interestingly, we found that Prednisolone promotes neurite outgrowth and provides a neuroprotective effect on SMA patient iPSC-derived motor neurons by reducing cell death. Data in vivo show that Prednisolone significantly extends the lifespan of SMA mice and confirm the neuroprotective action of the drug by dampening motor neuron cell death in the spinal cord of the treated animals. Moreover, we described positive trends in motor functionality of SMA mice without eliciting myopathy, which can be a side effect of chronic administration of the glucocorticoid. Finally, Prednisolone was unable to restore completely the transcriptome of myofibers in skeletal muscle of SMA mice, but we observed a positive trend in the expression of the myogenic transcript myogenin, which suggests an early re-innervation process of the muscle. Conclusions. This work extends the characterization of the effects of Prednisolone in vivo and provides further information on the impact of Prednisolone in vitro, conferring promising features as an SMN-inducing and neuroprotective factor, which can be exploited for future secondary therapies for SMA.

Contesto. L'atrofia muscolare spinale (SMA) è una malattia neuromuscolare autosomica recessiva caratterizzata da una disfunzione e degenerazione molto precoce dei motoneuroni α nel midollo spinale e nel tronco encefalico. Ciò dà origine ad un’atrofia muscolare prossimale progressiva e debolezza dei muscoli degli arti, del tronco e dei muscoli bulbari e respiratori, con conseguente paralisi flaccida e morte per insufficienza respiratoria nelle forme più gravi. La malattia è causata dalla delezione omozigote o dalla conversione genica del gene Survival Motor Neuron 1 (SMN1), che determina una riduzione dell’espressione della proteina SMN, essenziale per lo splicing e la maturazione dell'mRNA. Questo porta a disfunzioni a livello sistemico, con un coinvolgimento principalmente a livello dei motoneuroni e delle fibre muscolari. Nell'ultimo decennio sono state approvate tre terapie, ciascuna delle quali presenta dei difetti e, in ogni caso, risulta insufficiente come terapia risolutiva della SMA. Pertanto, cresce la necessità di identificare terapie secondarie, anche abbinate a quelle approvate, per migliorare gli effetti terapeutici. Il glucocorticoide sintetico Prednisolone è uno dei farmaci attenzionati come promettente terapia complementare. Risultati. Abbiamo testato il farmaco Prednisolone in vitro sul modello di motoneurone NSC-34, su fibroblasti derivati da pazienti SMA e su motoneuroni provenienti da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) derivate da pazienti affetti da SMA; ed in vivo nel modello murino di SMA SMNΔ7. I nostri dati in vitro mostrano che il Prednisolone è in grado di aumentare la trascrizione del gene SMN2, paralogo di SMN1, nei fibroblasti derivati dai pazienti e di influenzare la localizzazione subcellulare di SMN nelle cellule NSC-34. Inoltre, ha migliorato la crescita dei neuriti e fornito un effetto neuroprotettivo sui motoneuroni derivati da iPSC riducendone la morte cellulare. I dati in vivo dimostrano che il Prednisolone prolunga significativamente la sopravvivenza nei topi SMA e confermano l'azione neuroprotettiva del farmaco, che attenua la morte dei motoneuroni nel midollo spinale degli animali. Inoltre, abbiamo descritto tendenze migliorative nella funzionalità motoria dei topi SMA e assenza di miopatia, un effetto collaterale che può essere innescato dalla somministrazione cronica di glucocorticoidi. Infine, nonostante il Prednisolone non abbia ripristinato completamente il trascrittoma nelle miofibre dei muscoli scheletrici dei topi SMA, abbiamo osservato una tendenza positiva nell'espressione della miogenina, trascritto con proprietà miogeniche, che suggerisce uno stadio precoce di reinnervazione del muscolo. Conclusioni. Questo lavoro estende la caratterizzazione degli effetti del Prednisolone in vivo e aggiunge informazioni sull’impatto del Prednisolone in vitro, conferendo al farmaco due caratteristiche importanti: quella di fattore che induce l’espressione di SMN e quella di agente neuroprotettivo. Queste proprietà possono essere sfruttate in futuro per lo sviluppo di una terapia secondaria per la SMA.