Estrazione di parametri morfometrici da ricostruzioni nano-tomografiche tridimensionali di ovario di topo: sviluppo di modelli di classificazione automatica dei follicoli

The ovary is a dynamic organ, home to the processes of folliculogenesis, the maturation of the follicle, and steroidogenesis, the hormone production necessary for regulating folliculogenesis. The study of follicular development, and in particular the distinction between healthy follicles and follicles in atresia, the degenerative process affecting almost all follicles, has traditionally been based on histological analysis. This method, while reliable, can only provide a two-dimensional representation of intrinsically three-dimensional structures. The advent of nanocomputed tomography (nanoCT) has largely overcome this limitation, enabling the analysis of ovarian architecture in three dimensions with submicron resolution and the extraction of quantitative, objective, and comparable morphometric parameters across different samples and physiological states. Based on these premises, the main objective of this thesis was to develop a manual segmentation protocol, i.e., to identify and delineate follicular structures in murine ovarian nanoCT volumes. The segmentation masks were used, on the one hand, to extract morphometric parameters (volume, surface area, and mean voxel intensity) with subsequent statistical comparison between healthy and atretic follicles and, on the other, as a dataset for training an automatic segmentation model. The morphometric analysis, performed on the follicle masks (385 masks, of which 366 related to follicular structures and 19 to corpora lutea), highlighted that the alterations associated with atresia do not manifest uniformly, but follow stage-specific patterns. Follicular volume and surface area, closely related parameters, describe the follicle's geometry, while the mean nanoCT signal intensity reflects the follicle's density and cellular composition. Overall, these results suggest that morphometric information derived from segmentation masks can support the classification and distinction between healthy and atretic follicles, which is typically performed using morphological characteristics alone. Since manual follicle recognition and segmentation are time-consuming, the need arose to develop a deep learning model to automate the segmentation process. The selected model (UNETR, UNet Transformer), trained on manual segmentations of five ovaries, showed promising results toward automating the process. However, some limitations emerged, including the difficulty in separating adjacent follicular instances and performance variability as a function of the age of the analyzed organ. Overall, the work provides a reliable manual segmentation protocol and morphometric characterization of follicles in nanoCT volumes, identifying quantitative parameters associated with the atresia status in a stage-dependent manner. Starting from this study, we plan to expand the number of segmented samples, particularly adult ovaries, in order to strengthen the analysis of morphometric parameters, improve automatic semantic segmentation, and move towards instance-based segmentation, in which the model will be able to identify and classify individual follicular structures and attribute their follicular typology and physiological state.

L'ovario è un organo dinamico, sede dei processi di follicologenesi, ovvero il processo di maturazione del follicolo, e steroidogenesi, che consiste nella produzione ormonale, necessaria alla regolazione della follicologenesi. Lo studio dello sviluppo follicolare e, in particolare, la distinzione tra follicoli sani e follicoli in atresia, il processo degenerativo che interessa la quasi totalità dei follicoli, si è tradizionalmente basato sull'analisi istologica. Tale metodica, seppur affidabile, è capace di fornire soltanto una rappresentazione bidimensionale di strutture intrinsecamente tridimensionali. L'avvento della nanotomografia computerizzata (nanoCT) ha permesso di superare in larga parte questo limite, consentendo di analizzare l'architettura ovarica in tre dimensioni con risoluzione sub-micrometrica e di estrarre parametri morfometrici quantitativi, oggettivi e confrontabili tra campioni e stati fisiologici diversi. Su queste premesse, il presente lavoro di tesi ha avuto come obiettivo principale lo sviluppo di un protocollo di segmentazione manuale, ossia di identificazione e delimitazione delle strutture follicolari in volumi nanoCT di ovario murino. Le maschere di segmentazione sono state impiegate, da un lato, per l'estrazione dei parametri morfometrici (volume, superficie e intensità media dei voxel) con successivo confronto statistico tra follicoli sani e atresici e, dall'altro, come dataset per l’addestramento di un modello di segmentazione automatica. L'analisi morfometrica, svolta sulle maschere dei follicoli (385 maschere, di cui 366 relative a strutture follicolari e 19 ai corpi lutei), ha evidenziato che le alterazioni associate all'atresia non si manifestano in modo uniforme, ma seguono pattern stadio-specifici. Il volume e la superficie follicolare, parametri strettamente correlati tra loro, descrivono la geometria del follicolo, mentre l’intensità media del segnale nanoCT riflette la densità e la composizione cellulare dei follicoli. Questi risultati, nel complesso, suggeriscono che le informazioni morfometriche, ricavate dalle maschere di segmentazione, possono supportare la classificazione e la distinzione dei follicoli sani da quelli atresici, generalmente effettuata con le sole caratteristiche morfologiche. Richiedendo il riconoscimento e la segmentazione manuale dei follicoli molto tempo, è emersa la necessità di sviluppare un modello di deep learning volto ad automatizzare il processo di segmentazione. Il modello selezionato (UNETR, UNet Transformer), addestrato sulle segmentazioni manuali di 5 ovari, ha riportato risultati promettenti verso l'automazione del processo. Sono tuttavia emersi alcuni limiti, tra cui la difficoltà nel separare istanze follicolari adiacenti e la variabilità delle prestazioni in funzione dell'età dell'organo analizzato. Nel complesso, il lavoro fornisce un protocollo di segmentazione manuale affidabile e una caratterizzazione morfometrica dei follicoli in volumi nanoCT, individuando parametri quantitativi associati allo stato di atresia in modo stadio-dipendente. A partire da questo studio, è previsto l'ampliamento del numero di campioni segmentati, in particolare di ovari adulti, così da irrobustire l'analisi dei parametri morfometrici, migliorare la segmentazione semantica automatica e traslare verso la segmentazione per istanza, in cui il modello sarà capace di individuare e classificare le singole strutture follicolari e di attribuirne la tipologia follicolare e lo stato fisiologico.