Caratterizzazione di due isoforme proteiche del fattore di splicing alternativo e regolatore dell'angiogenesi Nova2

Nova2 is an alternative splicing (AS) and angiogenesis regulator. In endothelial cells, two Nova2 proteins are expressed: a 50 kDa canonical isoform (here referred as cNova2), and an uncharacterized 70 kDa protein (called SuperNova2), which is generated through the use of an alternative translational starting site located upstream of the canonical ATG. The aim of my Master’s Thesis was to characterize different functional properties of SuperNova2 compared to the canonical cNova2 protein. To do this, I used as an experimental model HeLa cells that are negative for Nova2 expression. HeLa were transfected with expression vectors allowing the production of cNova2 or SuperNova2 proteins. Total RNA and proteins were extracted from transfected cells and RT-PCR and Western blotting analysis were performed in order to determine the ability of Nova2 isoforms to affect AS. Whereas through Western blotting I confirmed expression of both Nova2 proteins in transfected HeLa cells, RT-PCR analysis allowed us to discover that SuperNova2 has different ability in regulating AS of exons compared to the canonical isoform. Interestingly, this property was both target-specific and dependent on the amount of vector used in the transfection experiments. I also studied the cellular localization of cNova2 and SuperNova2 proteins through immuno-fluorescence. These experiments indicated that SuperNova2 exhibits a significantly greater propensity to localize in the nucleus of transfected cell compared to cNova2. Collectively, my data demonstrates that SuperNova2 and cNova2 are functionally distinct proteins, strongly suggesting that their regulated expression or different cellular localization could have a diverse impact on angiogenesis. A further detailed characterization of Nova2 isoforms will expand our knowledge on the mechanisms orchestrating EC biology, thus providing a new perspective to understand angiogenesis.

Nova2 è un regolatore di splicing alternativo (AS) e angiogenesi. Nelle cellule endoteliali sono espresse due proteine di Nova2: una isoforma canoica da 50 kDa (qui chiamata cNova2) e una proteina non caratterizzata da 70 kDa (chiamata SuperNova2), che è generata tramite l'uso di un sito di traduzione alternativo localizzato a monte dell'ATG canonico. L’obiettivo della mia Tesi Magistrale è quindi di caratterizzare le diverse proprietà funzionali di SuperNova2 e paragonarle a quelle della proteina canonica cNova2. Per fare ciò, ho usato cellule HeLa come modello sperimentale, visto che non esprimono Nova2 naturalmente. Ho trasfettato le cellule HeLa con vettori di espressione in grado di produrre le proteine cNova2 o SuperNova2. Ho quindi ottenuto estratti totali di RNA e proteine da queste cellule trasfettate ed effettuato analisi di RT-PRC e Western blotting per studiare le capacità delle isoforme di Nova2 nel regolare l’AS. Mentre tramite Western ho potuto confermare l’espressione di entrambe le proteine di Nova2 nelle cellule HeLa trasfettate, l’analisi tramite RT-PCR ci ha permesso di scoprire che SuperNova2 ha una capacità differente rispetto all’isoforma canonica nel regolare dell’AS di esoni. In particolare, questa proprietà dipende sia dal target specifico analizzato sia dalla quantità di vettore di espressione utilizzato negli esperimenti di trasfezione. Ho anche studiato la localizzazione cellulare delle proteine cNova2 e SuperNova2 tramite immuno-fluorescenza. Questi esperimenti indicano che SuperNova2 mostra una propensione significativamente maggiore nel localizzarsi nel nucleo delle cellule trasfettate rispetto a cNova2. Nel complesso, i miei dati dimostrano che SuperNova2 e cNova2 sono proteine funzionalmente distinte, il che suggerisce fortemente che una regolazione della loro espressione o una loro diversa localizzazione cellulare potrebbero avere un impatto differente sull’angiogenesi. Una caratterizzazione più dettagliata delle isoforme di Nova2 espanderà la nostra conoscenza sui meccanismi che controllano la biologia delle EC, dando quindi una nuova prospettiva che ci permetta di comprendere l’angiogenesi.