Analisi del miRNoma di vescicole extracellulari e caratterizzazione di una coltura a lungo termine di cellule del cumulo di mammifero

The ovary is the primary female reproductive organ, responsible for folliculogenesis and hormone secretion. Within antral and Graafian follicles, granulosa cells differentiate into cumulus cells (CCs), which envelop the oocyte to form the cumulus-oocyte complex (COC). In vivo, CCs maintain metabolic and physical contact with the gamete, supporting its metabolism, modulating meiotic arrest and resumption, and enabling the acquisition of developmental competence. CCs can be isolated and cultured in vitro for a few days, serving as non-invasive biomarkers of oocyte quality and as a feeder layer releasing extracellular vesicles (EVs) containing active factors. Their quality and molecular signatures are studied in Assisted Reproductive Technology (ART) to predict or sustain oocyte maturation. This thesis work deepened the understanding of CC biology through a two-fold strategy: 1) identifying predictive molecular biomarkers of embryonic success; 2) optimizing a standardized long-term in vitro CC culture. First, the miRNome profiling of human CC-derived EVs cultured for 3 days was studied, comparing EVs associated with oocytes that successfully reached the blastocyst stage after fertilization versus those that failed (BLASTO vs NoBLASTO). A specific panel of differentially expressed miRNAs was identified; among these, 24 miRNAs are actively involved in signaling pathways for meiotic resumption, fertilization, follicle growth, and oocyte competence. Downstream bioinformatic analysis revealed an evolutionary convergence between human and mouse, which share 55 common miRNA target genes controlling cumulus expansion, fertilization, pre-implantation development, and meiotic resumption. This conservation validates pre-clinical murine models and suggests using CCs as an active feeder layer for in vitro maturation (IVM). Since short-term cultures (72 hours) are insufficient for human clinical applications, the second part established a long-term primary mouse CC culture to evaluate viability and functional retention up to 24 days. CCs maintained remarkable phenotypic, morphological, and functional stability, physiological rounded shape, and cellular uniformity up to day 18. A critical shift toward senescence occurred only by day 24, marked by a decline in LAMIN B1, cellular flattening, and upregulation of Ptx3, confirming its role as a senescence inducer. The expansion markers Has2 and Ptx3 underwent an early downregulation at day 8, reflecting adaptation to the in vitro monolayer. Overall, this study explores the role of CCs in female gamete maturation and ART protocols, establishing a baseline to validate CCs or their derivatives as strategies to enhance the quality of less competent gametes.

L'ovaio è il principale organo riproduttivo femminile, responsabile di follicogenesi e secrezione ormonale. Nei follicoli antrali e di Graaf, le cellule della granulosa si differenziano in cellule del cumulo (CC), che avvolgono l'ovocita formando il complesso cumulo-ovocita (COC). In vivo, le CC mantengono un contatto metabolico e fisico con il gamete, supportandone il metabolismo, modulando l'arresto e la ripresa meiotica e consentendo l'acquisizione della competenza dello sviluppo. Le CC possono essere isolate e coltivate in vitro per pochi giorni, fungendo sia da biomarcatore non invasivo della qualità ovocitaria, sia da feeder layer capace di rilasciare vescicole extracellulari (EV) contenenti fattori attivi. Qualità e firme molecolari delle CC sono studiate nelle tecnologie di riproduzione assistita (ART) per predire o sostenere la maturazione ovocitaria. Il lavoro di tesi ha approfondito la biologia delle CC tramite una duplice strategia: 1) identificare biomarcatori molecolari predittivi del successo embrionale; 2) ottimizzare una coltura in vitro standardizzata a lungo termine. Inizialmente è stato studiato il profilo del miRNoma di EV derivate da CC umane coltivate per 3 giorni, confrontando quelle associate a ovociti che hanno raggiunto lo stadio di blastocisti dopo la fecondazione con quelle che non lo hanno raggiunto (BLASTO vs NoBLASTO). È stato identificato un pannello di miRNA differenzialmente espressi: tra questi, 24 sono attivamente coinvolti in vie di segnalazione specifiche per ripresa meiotica, fecondazione, crescita follicolare e competenza ovocitaria. L'analisi bioinformatica ha rivelato una convergenza evolutiva tra uomo e topo, che condividono 55 geni target dei miRNA che controllano espansione del cumulo, fecondazione, sviluppo pre-impianto e ripresa meiotica. Questa conservazione convalida i modelli murini pre-clinici e suggerisce l'uso delle CC come feeder layer attivo per la maturazione in vitro (IVM). Poiché le colture a breve termine (72 ore) sono insufficienti per le applicazioni cliniche umane, la seconda parte del lavoro ha stabilito una coltura primaria a lungo termine di CC di topo per valutarne vitalità e funzionalità fino a 24 giorni. Le CC hanno mantenuto stabilità fenotipica, morfologica e funzionale, forma rotondeggiante fisiologica e uniformità cellulare fino al giorno 18. Una transizione critica verso la senescenza si è verificata solo al giorno 24, evidenziata da riduzione di LAMIN B1, appiattimento cellulare e upregulation di Ptx3, confermando il suo ruolo di induttore di senescenza. I marcatori di espansione Has2 e Ptx3 hanno subito una precoce downregulation al giorno 8, riflettendo un adattamento al monostrato in vitro. Questo studio approfondisce il ruolo delle CC nella maturazione del gamete femminile e nelle ART, stabilendo una base per validare in futuro le CC o i loro derivati come strategie per migliorare la qualità dei gameti meno competenti.