Studio delle basi molecolari dell’equilibrio tra PKA e fosfatasi nel nucleo

ABSTRACT Cyclic adenosine monophosphate/Protein kinase A (cAMP/PKA) axes is an intracellular transduction signalling pathway that can orchestrate a wide array of cell processes, ranging from metabolic homeostasis to gene expression. To guarantee the specificity of action of the effector of the cascade PKA, this cascade is regulated in space and time thanks to a fine compartmentalization of the signalling components. Notably, alterations in the regulatory mechanisms are extensively correlated to pathological conditions and aging. However, the molecular cues of age-related pathophysiological signalling changes remain underappreciated. To further investigate the roles of PKA inside the nuclei of agerelated phenotypes, we used novel nuclear FRET-based biosensors (H2B-AKAR4), in HeLa cells expressing a mutated form of LMNA encoding for Progerin, the driver of Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome (HGPS) and in ex vivo electroporated skeletal muscle fibers of young and aged mice (flexor digitorum brevis, FDB). These live-cell imaging approached allowed us to identify an age-dependent shift of nuclear PKA signature, given by a reduction of the nuclear phosphatase pressure with aging and in Progeria. Next, we aimed at mimicking chronic in vitro PKA activation by chemically maximizing endogenous cAMP production. Strikingly, immunofluorescence assays on stimulated HeLa cells revealed a peculiar PKA-dependent phosphorylation pattern, which apparently deviates from the acute results obtained with FRET-based experiments. A deep analysis of these preliminary results leads us to hypothesize that a crosstalk mechanism between the cAMP/PKA cascade with other kinases inhibited by PKA may be established upon chronic activation. Together this work highlights a marked modification of the PKA signalling signature in ageing and in age-related syndromes, and that the chronic activation of PKA may trigger other kinase’s signals.

RIASSUNTO L'asse adenosina monofosfato ciclico/proteina chinasi A (cAMP/PKA) è una via di trasduzione del segnale intracellulare in grado di orchestrare un'ampia gamma di processi cellulari, che variano dall'omeostasi metabolica all'espressione genica. Per garantire la specificità d'azione della PKA, l'effettore della cascata, questa via è regolata nello spazio e nel tempo grazie a una fine compartimentalizzazione dei suoi componenti di segnalazione. In particolare, le alterazioni dei meccanismi di regolazione sono ampiamente correlate a condizioni patologiche e all'invecchiamento. Tuttavia, le cause molecolari dei cambiamenti di segnalazione fisiopatologici legati all'età rimangono poco compresi. Per studiare ulteriormente il ruolo della PKA all'interno dei nuclei nei fenotipi legati all'età, abbiamo utilizzato innovativi biosensori nucleari basati sul costrutto FRET (H2B-AKAR4) in cellule HeLa che esprimono una forma mutata di LMNA codificante per la Progerina, il motore della Sindrome di Progeria di Hutchinson-Gilford (HGPS), e in fibre muscolari scheletriche (flexor digitorum brevis, FDB) elettroporate, di topi giovani e anziani. Questi approcci di imaging in vivo (live-cell imaging) ci hanno permesso di identificare un cambiamento del profilo della PKA nucleare dipendente dall'età, determinato da una riduzione della pressione fosfatasica nucleare con l'invecchiamento e nella Progeria. Successivamente, abbiamo mirato a mimare l'attivazione cronica in vitro della PKA, massimizzando chimicamente la produzione endogena di cAMP. Sorprendentemente, i saggi di immunofluorescenza su cellule HeLa stimolate hanno rivelato un peculiare pattern di fosforilazione dipendente da PKA, che apparentemente devia dai risultati acuti ottenuti con gli esperimenti basati sul FRET. Un'analisi approfondita di questi risultati preliminari ci porta a ipotizzare che, in seguito all'attivazione cronica, possa instaurarsi un meccanismo di crosstalk tra la cascata cAMP/PKA e altre chinasi inibite dalla PKA stessa. Nel complesso, questo lavoro evidenzia una marcata modifica del profilo di segnalazione della PKA nell'invecchiamento e nelle sindromi correlate all'età, e dimostra che l'attivazione cronica della PKA può innescare i segnali di altre chinasi.