Identificazione basata sulla struttura di nuovi inibitori di COQ8 e COQ10 da librerie chimiche Ultra-Large

Aberrations in metabolic physiology disrupt cellular energy production and reactive metabolite management across organisms. Coenzyme Q (CoQ) is central to these processes; its deficiency impairs neural, muscle and renal tissues. Recent evidence shows metabolic discrepancies are more widespread than previously thought, often arising as secondary effects of diverse dysregulating conditions. Cancer is a major contributor, being fundamentally a metabolic disease. Many cancers increase CoQ levels in different tissues, a phenomenon that can be exploited therapeutically by inhibiting CoQ biosynthesis. Targeting biosynthetic proteins with small-molecule inhibitors could address cancer hallmarks while offering alternatives to conventional therapies. Emerging pathways, such as ferroptosis and FSP1-mediated protection, highlight new vulnerabilities to target. In silico methods have already helped discover ligands with strong affinities against proteins involved in oxidative stress, cell death, and proliferation. This thesis aimed to identify and biochemically characterize novel inhibitors of COQ8 and COQ10 that show high binding affinity. Ultra-large virtual screens evaluated millions of compounds, including multiple conformers, and produced a couple of dozen synthesized candidates predicted to have desirable properties. These compounds were screened against ancestral COQ8 and COQ10 proteins that were recombinantly expressed and purified from E. coli. Initial thermal-shift screening identified ~10 protein-specific compounds that significantly stabilized their target proteins, which advanced to further characterization. Binding specificity and affinity were then assessed using biophysical methods including microscale thermophoresis (MST) and stopped-flow kinetics. This narrowed candidates to 2 3 high-confidence compounds per target. For COQ8, a single compound displayed mid to high inhibitory activity in the micromolar range against one paralogue while exhibiting minimal effect on the other paralogue. For COQ10, stopped-flow assays likewise identified one compound with considerable binding affinity. Structural studies were attempted through inhibitor soaking and co-crystallization to define binding modes. Crystallization with COQ8 candidates failed to yield corresponding electron densities to the inhibitor, whereas COQ10 yielded a structure in which the lead compound was observed bound in the protein. Given the goal of generating inhibitors with low-nanomolar affinities suitable for further drug development, future work should include screening of de novo and expanded virtual libraries, since the subset screened here represents only a tiny fraction of chemical space. Structure guided lead optimization and rational design, leveraging the COQ10 co-structure and any forthcoming COQ8 structural data, will be essential to improve potency, selectivity, and drug like properties. Additional cellular and in vivo studies will be required to test whether modulating CoQ biosynthesis can selectively impair cancer metabolic adaptations and synergize with ferroptosis- or FSP1-targeted strategies.

Le alterazioni della fisiologia metabolica compromettono i processi cellulari coinvolti nella produzione di energia e nella gestione dei metaboliti reattivi. Il coenzima Q (CoQ) svolge un ruolo centrale in questi processi, la sua carenza provoca infatti disfunzioni nei tessuti nervosi, muscolari e renali. Evidenze recenti indicano che le anomalie metaboliche sono più diffuse di quanto si ritenesse in passato e spesso insorgono come effetti secondari di diverse condizioni patologiche. Il cancro rappresenta uno dei principali fattori coinvolti, essendo fondamentalmente una malattia del metabolismo. Numerosi tumori determinano un aumento dei livelli di CoQ in differenti tessuti, un fenomeno che può essere sfruttato terapeuticamente mediante l’inibizione della sua biosintesi. Il targeting delle proteine coinvolte in questo processo tramite piccole molecole inibitorie potrebbe contrastare caratteristiche fondamentali del cancro e offrire un’alternativa alle terapie convenzionali. Inoltre, nuove vie metaboliche emergenti, come la ferroptosi e la protezione mediata da FSP1, evidenziano ulteriori vulnerabilità terapeutiche. I metodi in silico hanno già dimostrato la loro efficacia nell’identificazione di ligandi ad alta affinità per proteine coinvolte nello stress ossidativo, nella morte cellulare e nella proliferazione. L’obiettivo di questa tesi è stato identificare e caratterizzare biochimicamente nuovi inibitori delle proteine COQ8 e COQ10 dotati di elevata affinità di legame. A tal fine, sono stati eseguiti screening virtuali su larga scala che hanno valutato milioni di composti chimici e delle loro conformazioni spaziali, portando alla selezione e alla sintesi un paio di dozzine candidati promettenti. Tali composti sono stati testati contro le proteine ancestrali COQ8 e COQ10, espresse e purificate da sistemi di espressione in E. coli. Uno screening preliminare basato su saggi di stabilità termica ha identificato circa 10 composti specifici per ciascuna proteina, capaci di aumentarne significativamente la stabilità e quindi meritevoli di ulteriori analisi. La specificità e l’affinità di legame sono state successivamente valutate mediante termoforese su microscala (MST) e cinetica stopped-flow. Questi esperimenti hanno ristretto il numero dei candidati a 2–3 composti ad alta affidabilità per ciascun bersaglio. Nel caso di COQ8, un singolo composto ha mostrato una media-alta attività inibitoria nell’intervallo micromolare verso uno dei paraloghi, esercitando effetti minimi sull’altro. Analogamente, per COQ10, gli esperimenti di stopped-flow hanno individuato un composto caratterizzato da una considerevole affinità di legame. Per definire le modalità di interazione tra proteina e ligando sono stati condotti studi strutturali mediante soaking e co-cristallizzazione. La cristallizzazione con i candidati COQ8 non è riuscita a produrre densità elettroniche corrispondenti all'inibitore, mentre con COQ10 è stata ottenuta una struttura nella quale il composto capofila è stato osservato legato alla proteina. Poiché l’obiettivo finale consiste nello sviluppo di inibitori con affinità nell’intervallo dei bassi nanomolari e potenzialmente idonei a un successivo sviluppo farmacologico, le prospettive future includono lo screening di nuove librerie virtuali e de novo, considerando che i composti analizzati rappresentano soltanto una minima frazione dello spazio chimico esplorabile. L’ottimizzazione strutturalmente guidata dei composti guida e approcci di progettazione razionale saranno fondamentali per migliorarne potenza, selettività e proprietà farmacologiche. Saranno inoltre necessari studi cellulari e in vivo per verificare se la modulazione della biosintesi del CoQ possa compromettere selettivamente gli adattamenti metabolici delle cellule tumorali e agire in sinergia con strategie terapeutiche mirate alla ferroptosi o alla via FSP1.