Indagine sul meccanismo molecolare della produzione temperatura-dipendente di γ-PGA in Bacillus subtilis

Poly-γ-glutamic acid (γ-PGA) is an extracellular polymer produced by Bacillus subtilis with diverse biological and biotechnological applications. The γ-PGA biosynthetic operon, pgs, is activated by phosphorylated DegU (DegU-P) and SwrA. The DegS-DegU two-component system is a well-characterized regulatory pathway that controls a wide range of physiological processes occurring during the stationary phase of growth in B. subtilis. Conversely, much less is known about the small regulatory protein SwrA, despite its established roles in bacterial motility and γ-PGA production, both mediated by its interaction with DegU-P. γ-PGA production is strongly influenced by environmental conditions, including temperature, but the regulatory mechanisms underlying its temperature dependence remain obscure. This study investigates the molecular mechanisms underlying temperature-dependence of γ-PGA biosynthesis in B. subtilis, addressing the contributions of SwrA and DegU-P. It was verified that pgsB expression, which reflects the activation of the γ-PGA biosynthetic pathway, was substantially reduced at 24 °C compared with 37 °C. Analysis of swrA mRNA secondary structure predictions identified a potential hairpin structure that could sequester the ribosome-binding site at lower temperatures, functioning as a potential RNA thermometer. To test this hypothesis, a targeted mutation was introduced to disrupt the predicted structure and its potential role in temperature-dependent swrA expression was investigated. It was shown that the mutation did not restore γ-PGA production at 24 °C. Furthermore, the wild-type swrA allele showed higher expression than the mutant swrA allele at both 24 °C and 37 °C. Consistent with this observation, swrA overexpression from an inducible promoter did not restore γ-PGA production at 24 °C. In addition, aprE expression, known to be induced by DegU-P alone and on which SwrA has a negative impact, was investigated as a readout of DegU-P activity. In a ΔswrA background, aprE expression was strongly reduced at 24 °C compared with 37 °C. Together, these findings indicate that the temperature dependence of γ-PGA production is primarily associated with reduced DegU-P activity at 24 °C rather than with temperature-dependent swrA expression. The mechanism that controls the temperature-dependence of DegU-P activity remains to be investigated.

L'acido poli-γ-glutammico (γ-PGA) è un polimero extracellulare prodotto da Bacillus subtilis con diverse applicazioni biologiche e biotecnologiche. L'operone biosintetico del γ-PGA, pgs, è attivato dalla forma fosforilata di DegU (DegU-P) e da SwrA. Il sistema a due componenti DegS-DegU è un sistema di regolazione ben caratterizzato che controlla un'ampia gamma di processi fisiologici che avvengono durante la fase stazionaria della crescita in B. subtilis. Al contrario, si sa molto meno sulla piccola proteina regolatoria SwrA, nonostante il suo ruolo consolidato nella motilità batterica e nella produzione di γ-PGA, entrambi mediati dalla sua interazione con DegU-P. La produzione di γ-PGA è fortemente influenzata dalle condizioni ambientali, tra cui la temperatura, ma i meccanismi di regolazione alla base della sua dipendenza dalla temperatura rimangono oscuri. Questo studio analizza i meccanismi molecolari alla base della dipendenza dalla temperatura della biosintesi del γ-PGA in B. subtilis, esaminando il contributo di SwrA e DegU-P. È stato verificato che l'espressione di pgsB, che riflette l'attivazione della via biosintetica del γ-PGA, risulta sostanzialmente ridotta a 24 °C rispetto a 37 °C. L'analisi delle predizioni della struttura secondaria dell'mRNA di swrA ha identificato una potenziale struttura a forcina (hairpin) che potrebbe sequestrare il sito di legame del ribosoma a bassa temperatura, fungendo da potenziale termometro a RNA. Per verificare questa ipotesi, è stata introdotta una mutazione mirata a destabilizzare la struttura predetta, ed è stato studiato il suo potenziale ruolo nell'espressione di swrA dipendente dalla temperatura. I risultati hanno mostrato che la mutazione non ha ripristinato la produzione di γ-PGA a 24 °C. Inoltre, l’allele swrA wild-type ha mostrato un’espressione maggiore rispetto all’allele swrA mutante sia a 24 °C sia a 37 °C. In linea con questa osservazione, la sovraespressione di swrA da un promotore inducibile non ha ripristinato la produzione di γ-PGA a 24 °C. Inoltre, l'espressione di aprE, nota per essere indotta solo da DegU-P e sulla quale SwrA ha un impatto negativo, è stata studiata come indicatore (readout) dell'attività di DegU-P. In un background ΔswrA, l'espressione di aprE è risultata fortemente ridotta a 24 °C rispetto a 37 °C. Insieme, questi risultati indicano che la dipendenza dalla temperatura della produzione di γ-PGA è associata principalmente a una ridotta attività di DegU-P a 24 °C, piuttosto che a un'espressione di swrA dipendente dalla temperatura. Il meccanismo che controlla la dipendenza dalla temperatura dell'attività di DegU-P resta ancora da chiarire.