Riorganizzazione cromatinica durante stress ossidativo: studio in un modello in vitro di epatociti murini

L’ampio utilizzo del bromato di potassio (KBrO3) come additivo alimentare ed il suo utilizzo nell’industria cosmetica e farmaceutica rendono particolarmente interessante lo studio degli effetti di questa sostanza ossidante. Sulla base delle nostre conoscenze, gli effetti del KBrO3 sulle modifiche epigenetiche e sull’organizzazione della cromatina, che giocano un ruolo chiave nella regolazione dell’espressione genica, risultano ancora poco investigati. Per questo studio sono state utilizzate cellule epatiche murine AML-12 (alpha mouse liver 12), in considerazione dell’elevato livello trascrizionale e del loro rappresentare un gold standard come modello di studio di fegato ed epatociti. Dopo aver confermato la formazione di DSBs indotti da KBrO3 attraverso l’analisi del marcatore γ-H2AX, è stato valutato il rimodellamento cromatinico con analisi ultrastrutturali svolte tramite staining con ammina d’osmio (OA), che hanno evidenziato come il trattamento con KBrO3 induca un aumento della condensazione della cromatina, accompagnato dalla formazione di nuovi cluster di eterocromatina. Per investigare potenziali alterazioni generali nell’espressione genica sono state effettuate analisi di pulse-chase con 5-bromouridina (BrU), che ha evidenziato una riduzione del segnale fluorescente della BrU e una graduale ripresa nel successivo periodo di recovery, ed analisi sul marcaggio di hnRNP A/B, che ha mostrato una riduzione di questi fattori coinvolti in diversi processi di maturazione degli RNA. I dati ottenuti sul profilo epigenetico tramite immunogold labelling evidenziano una riduzione significativa del marcaggio per H3K4me3 e 5hmC, associate ad un profilo generalmente favorevole alla trascrizione. Tuttavia, appaiono discordanti i dati sulle ulteriori analisi della metilazione del DNA, che vedono una perdita globale di 5mC e della de novo metiltransferasi DNMT3A. Considerata singolarmente, la 5mC, modifica associata al silenziamento genico e ad una cromatina più compatta, non può quindi giustificare in questo scenario la formazione di cluster di cromatina condensata dovuta al trattamento con KBrO3. L’analisi a livello ultrastrutturale dei cluster di eterocromatina ha evidenziato come essi risultino arricchiti alla loro periferia per i marcatori γ-H2AX e H3K4me3: casi analoghi sono riportati in letteratura per facilitare l’accesso del macchinario di segnalazione e riparo ai siti di DSBs e ridurre la probabilità di errori nella riparazione. Infine, analisi di live cell imaging sulla dinamica dei cluster ha evidenziato il loro spostamento presso l’involucro nucleare e, come descritto in letteratura, questo evento potrebbe garantire una riparazione non aberrante di cluster di sequenze ripetute. Future analisi potranno essere indirizzate a delineare in modo più completo il cambiamento del profilo epigenetico, il coinvolgimento di specifici geni e RNA, e la caratterizzazione più approfondita dei cluster di eterocromatina, per investigare il legame tra stress ossidativo, organizzazione della cromatina e regolazione dell’espressione genica.