Effetti dell'esposizione a 1nM di cipermetrina sullo sviluppo in vitro dell'embrione murino in fase di preimpianto

Cypermethrin (CYP) is a synthetic pyrethroid insecticide widely used in agriculture. Due to its extensive application, CYP has become one of the major environmental pollutants worldwide. It is well established that CYP, entered into the body via contaminated food and water consumption or lipophilic absorption, exerts toxic effects in mammals and aquatic organisms. While the toxicological impact of CYP on adult tissues and gonads is well documented, its effects on preimplantation embryo development remains largely unexplored. The aim of this thesis is to address this gap by evaluating CYP-induced alterations on preimplantation embryo development rate and assessing the quality of treated blastocyst, both morphological and molecular perspectives. Embryos were generated via in vitro fertilization and assigned to two experimental groups: a control group (CTR), cultured under physiological laboratory conditions, and treated group (CYP), exposed to 1 nM CYP in developmental culture starting 3 hours post-insemination. The results demonstrated that CYP significantly decreases preimplantation embryo development rates across all evaluated checkpoints, including 2-cell, 4-cell, morula and blastocyst stages; Furthermore, CYP-treated embryos that reach blastocyst stage exhibit reduced quality compared to CTR, characterised by a lower total number of cells and a markedly higher cell death rate. This increase in apoptosis was observed globally as well as within the inner cell mass and trophectoderm lineages individually. Consistently with these morphological findings, microarray combined to bioinformatic analyses revealed that CYP alters blastocyst transcriptome, disrupting key regulators of metabolic pathways, cell cycle control, the oxidative response, cell differentiation, and pluripotency maintenance. These molecular alterations likely compromise the developmental competence of surviving blastomeres, impairing the expansion process and ultimately reducing overall developmental yields. Taken together, these findings demonstrate that environmental exposure to CYP during the preimplantation window compromises both the developmental competence and molecular integrity of mouse embryos. Future prospectives will focus on: - Stage-specific transcriptomics: Analyzing early and expanded blastocysts separately to isolate the drivers of expansion failure. - Protein validation: Quantifying key targets (e.g., via Western blot/IF) to confirm that mRNA alterations manifest at the protein level. - In vivo functional assays: Performing embryo transfers in mice to evaluate the impact of CYP exposure on implantation and post-implantation development.

La cipermetrina (CYP) è un insetticida appartenente alla famiglia dei piretroidi e negli anni, a causa del suo massivo utilizzo, è diventata uno dei maggiori inquinanti ambientali al mondo. In letteratura, è noto che l'insetticida, introdotto nell'organismo attraverso l'assunzione di acqua e cibo contaminati o tramite assorbimento lipofilo, esercita effetti tossici nei mammiferi e nei pesci. In particolare, l'azione della CYP sui tessuti dell'organismo umano adulto e sulle gonadi è ben caratterizzata, ma gli effetti dell'insetticida sullo sviluppo embrionale preimpianto rimangono ancora poco noti. Lo scopo della mia tesi è colmare questa lacuna di conoscenze, valutando le alterazioni indotte dalla CYP sul tasso di sviluppo embrionale in fase di preimpianto e sulla qualità della blastocisti, sia dal punto di vista morfologico che molecolare. Gli embrioni utilizzati negli esperimenti sono stati ottenuti mediante tecnica di fecondazione in vitro (IVF) e, per ciascuna analisi, sono stati considerati un gruppo di controllo (CTR) coltivato in condizioni fisiologiche di laboratorio e un gruppo trattato (CYP), che indica embrioni coltivati, per tutto lo sviluppo embrionale, in presenza di 1 nM di CYP a partire 3 ore post-inseminazione. I risultati ottenuti mostrano che la CYP riduce significativamente i tassi di sviluppo embrionale in fase preimpianto in tutti i checkpoint considerati per la valutazione, a partire dallo stadio di embrione a 2 cellule, 4 cellule, morula e blastocisti. Gli embrioni del gruppo CYP che raggiungono lo stadio di blastocisti, inoltre, presentano un numero totale di blastomeri significativamente minore rispetto a quelli di CTR e sono caratterizzati da un tasso di morte cellulare significativamente più elevato, senza mostrare diversa localizzazione se si considerano le due linee differenziative di massa cellulare interna e trofectoderma. Inoltre, una successiva analisi tramite microarray combinata ad un’analisi bioinformatica ha messo in evidenza che la CYP altera il trascrittoma della blastocisti trattate e influenza l'espressione di regolatori chiave delle vie metaboliche, del controllo del ciclo cellulare, della risposta ossidativa, del differenziamento cellulare e delle vie di mantenimento della pluripotenza. Nel complesso, questi risultati dimostrano che un'esposizione a 1 nM di CYP durante la finestra di sviluppo embrionale preimpianto compromette la competenza dello sviluppo sia l'integrità molecolare degli embrioni murini. Le prospettive future si concentreranno su: - Trascrittomica stadio-specifica: Analizzando separatamente le blastocisti a momenti diversi di sviluppo (precoci o espanse) per isolare il time di alterazione dei fattori molecolari che risultano essere deregolati. - Validazione proteica: quantificando i bersagli chiave (es. tramite Western blot o immunofluorescenza) per confermare che le alterazioni dell'mRNA si riflettano a livello proteico. - Saggi funzionali in vivo: eseguendo un trasferimento embrionale in modelli murini per valutare l'impatto dell'esposizione a CYP sull'impianto e sullo sviluppo post-impianto.