Screening di formulazioni di nanoparticelle lipidiche funzionalizzate con peptidi per la veicolazione oculare di mRNA

Usher syndrome type 1B is a rare autosomal recessive disorder caused by mutations in the MYO7A gene, which encodes myosin VIIa, an actin-dependent molecular motor involved in intracellular transport in photoreceptors and in the retinal pigment epithelium. Loss of its function results in progressive photoreceptor degeneration, for which no resolutive therapy is currently available. Gene transfer by adeno-associated viral vectors is limited by the ~6.7 kb length of the MYO7A coding sequence, which exceeds the loading capacity of the viral vector (~4.7 kb). Conventional lipid nanoparticles (LNPs) administered subretinally overcome this size constraint but have shown poor tropism for photoreceptors. The present work is part of a project aimed at developing peptide-functionalised LNPs for the targeted delivery of the CRISPR-Cas9 system (Cas9 mRNA and sgRNA) to photoreceptors. The objective of this thesis was the development and optimisation of the carrier, using EGFP (enhanced Green Fluorescent Protein) mRNA as a reporter. Four formulations were produced by microfluidics: two conventional formulations (A and B), differing in their ionizable lipid content, and two formulations both conjugated with peptide 1 but differing in their helper lipid (C, DOPE; D, DSPC). The formulations were first characterised in terms of their physicochemical properties, namely hydrodynamic diameter, polydispersity index (PDI), zeta potential and colloidal stability over 24 hours. All formulations maintained a diameter below 100 nm after dialysis, with PDI values complying with the specifications reported for RNA-loaded LNPs. Conjugation of peptide 1 to C and D was confirmed by the inversion of the zeta potential and quantified by RP-HPLC. However, functionalisation was tolerated only by C, whereas D more than doubled its diameter, a behaviour attributable to the choice of helper lipid. The four formulations were subsequently analysed for encapsulation efficiency and for transfection capability in A549 human lung adenocarcinoma cells, used as a screening platform. In the presence of Lipofectamine™ 2000, all formulations produced a high and comparable EGFP fluorescent signal, suggesting that neither encapsulation efficiency nor the integrity of the EGFP mRNA represents a limiting factor. In the absence of Lipofectamine™ 2000, however, expression was markedly reduced, and became undetectable for conjugated formulation D. The limiting step may therefore lie in cellular internalisation or in endosomal escape. Formulation C produced the most intense signal in terms of transfection efficiency, despite showing the lowest amount of encapsulated mRNA among the four, as quantified by the RiboGreen™ assay. It was also the only formulation to retain a detectable level of transfection after conjugation, although reduced compared with its non-functionalised counterpart. In conclusion, among the four formulations tested, C proved to be the only one combining colloidal stability, compatibility with the peptide and effective delivery at doses that do not compromise cell viability and therefore represents the platform on which alternative peptides should be evaluated. The identification of a peptide capable of improving delivery is a prerequisite for the subsequent transfer of this platform to a cell model representative of photoreceptors.

La sindrome di Usher di tipo 1B è una sindrome autosomica recessiva rara, causata da mutazioni nel gene MYO7A, codificante la miosina VIIa, motore molecolare actina-dipendente implicato nel trasporto intracellulare a livello dei fotorecettori e dell'epitelio pigmentato retinico. Il deficit funzionale determina una degenerazione progressiva dei fotorecettori, per la quale non sono ad oggi disponibili terapie risolutive. Il trasferimento genico mediante vettori Adeno-associati è limitato dalla lunghezza di ~6,7 kb della sequenza codificante MYO7A, che eccede la capacità di carico del vettore virale (~4,7 kb). Le nanoparticelle lipidiche (LNPs) convenzionali somministrate per via sub-retinica superano questo limite dimensionale, ma hanno mostrato scarso tropismo per i fotorecettori. Il presente lavoro si inserisce in un progetto volto a sviluppare LNPs funzionalizzate con peptidi per il veicolamento mirato del sistema CRISPR-Cas9 (Cas9 mRNA e sgRNA) ai fotorecettori. Obiettivo della tesi è stato lo sviluppo e l’ottimizzazione del vettore, utilizzando EGFP (enhanced Green Fluorescent Protein) mRNA come reporter. Quattro formulazioni sono state prodotte mediante la tecnica della microfluidica: due formulazioni convenzionali (A e B), diverse per contenuto di lipide ionizzabile, e due formulazioni coniugate entrambe con il peptide 1, ma differenti per lipide helper (C, DOPE; D, DSPC). Le formulazioni sono state, inizialmente, caratterizzate per proprietà chimico-fisiche, quali diametro idrodinamico, indice di polidispersione (PDI), potenziale zeta, stabilità colloidale a 24 ore. Tutte le formulazioni hanno mantenuto dopo dialisi un diametro inferiore a 100 nm e PDI conformi alle specifiche riportate per LNP a RNA. La coniugazione del Peptide 1 su C e D è stata confermata dall'inversione del potenziale zeta e quantificata mediante RP-HPLC. Tuttavia, la funzionalizzazione è stata tollerata unicamente da C, mentre D ha più che raddoppiato il proprio diametro, comportamento attribuibile alla scelta del lipide helper. Successivamente, le quattro formulazioni sono state analizzate per efficienza di incapsulamento, e per capacità transfettante su cellule umane di adenocarcinoma polmonare, A549 impiegata come piattaforma di screening. In presenza di Lipofectamine™ 2000, tutte le formulazioni hanno prodotto segnale fluorescente EGFP elevato e comparabile, suggerendo che né l’efficienza di incapsulamento né l’integrità dell’mRNA della EGFP costituiscono fattori limitanti. Tuttavia, in assenza di Lipofectamine™ 2000, l'espressione è risultata marcatamente ridotta, fino a non essere rilevabile per la formulazione D coniugata. Il limite pertanto potrebbe essere riconducibile al processo di internalizzazione o di “escape” endosomiale. La formulazione C ha prodotto il segnale più intenso in termini di efficienza di trasfezione, pur presentando la quantità di mRNA incapsulato più bassa delle quattro, quantificata mediante saggio RiboGreen™. Inoltre, è risultata l’unica a conservare un livello di trasfezione rilevabile dopo coniugazione, sebbene ridotto rispetto alla controparte non funzionalizzata. In conclusione, la formulazione C si è rivelata essere delle quattro formulazioni testate, l’unica in grado di coniugare stabilità colloidale, compatibilità con il peptide ed efficacia di veicolazione, a dosi che non compromettono la vitalità cellulare, e costituisce pertanto la piattaforma sulla quale valutare peptidi alternativi. L’identificazione di un peptide in grado di migliorare la veicolazione costituisce il presupposto per il successivo trasferimento della piattaforma su un modello cellulare rappresentativo dei fotorecettori.