Glioblastoma Multiforme (GBM) is the most common and aggressive malignant tumour of the central nervous system, classified as grade IV malignant astrocytoma by World Health Organization (WHO) and characterized by resistance to conventional treatments and rapid cell proliferation. Despite the adoption of conventional therapeutic strategies including surgical resection, radiation therapy and chemotherapy with Temozolomide, the clinical outcome remains poor. There are several reasons underlying this therapeutic failure, as the profound tumour microenvironment heterogeneity, the incapacity of the drugs to fully penetrate the blood-brain barrier and the intrinsic resistance related to glioma stem cells (GSCs). Mitochondria represent key organelles for tumorigenesis; through horizontal mitochondrial transfer, mitochondria DNA hypermutation and Warburg effect, they promote proliferation and surviving of tumoral cells in stress conditions. Considering the importance of mitochondria in tumour progression, they represent the target of this experimental thesis and constitute an innovative therapeutic approach. This thesis presents the preclinical in vitro analysis of 7 novel cytotoxic compounds, named PV1-7. The efficacy of these experimental molecules was tested on established human glioblastoma (T98G and U-87 MG) and murine cells (GL261), employing primary rat astrocytes and human fibroblast as controls to test the toxicity of the compounds on healthy tissues. The analysis achieved through spectrofluorimetric, and confocal microscopy demonstrated that the newly synthetized compounds are able to spontaneously cross plasma membranes, localizing selectively within mitochondria. Furthermore, MTT viability assay and morphological evaluation highlighted a marked, time-dependent cytotoxicity, in particular for PV3 and PV6. Contrarily, the same molecules demonstrated a prominent selectivity, keeping astrocytes and fibroblasts cell cultures unaffected. Investigating the mutagenic potential of the novel compounds, 4-NBP alkylating assay was performed. The results suggested marked alkylating capacity of PV3 and PV6, resembling Temozolomide effects. Mutagenetic effects were also demonstrated by Long Real-Time PCR on mtDNA, particularly for PV3 and PV6. Furthermore, DHE assay was performed, in order to investigate mitochondria functionality, demonstrating a profound oxidative stress and accumulation of reactive oxidative species (ROS) induced specifically by PV1, PV3 and PV6. JC-1 assay also documented the accumulation of depolarized mitochondria following PV3 treatment in tumour cells. At ultrastructural level, TEM observation confirmed mitochondrial damage in PV3-treated cells: organelles displayed abnormal cristae distribution within the organelles. In conclusion, this preliminary in vitro analysis indicated the potentiality of at least one novel compound, i.e. PV3, to induce cytotoxicity in tumour cells and mtDNA mutations, opening to more advanced experimental analysis.
Il glioblastoma multiforme (GBM) è il tumore maligno del sistema nervoso centrale più comune e aggressivo; classificato dall'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) come astrocitoma maligno di grado IV, è caratterizzato da resistenza ai trattamenti convenzionali e da una rapida proliferazione cellulare. Nonostante l'adozione di strategie terapeutiche convenzionali, tra cui resezione chirurgica, radioterapia e chemioterapia con temozolomide, l'esito clinico rimane sfavorevole. Alla base di questo fallimento terapeutico vi sono diverse ragioni, quali l'elevata eterogeneità del microambiente tumorale, l'incapacità dei farmaci di attraversare completamente la barriera emato-encefalica e la resistenza intrinseca legata alle cellule staminali di glioma (GSC). I mitocondri rappresentano organelli chiave per la genesi del tumore; attraverso il trasferimento mitocondriale orizzontale, l'ipermutazione del DNA mitocondriale e l'effetto Warburg, essi favoriscono la proliferazione e la sopravvivenza delle cellule tumorali in condizioni di stress. Data l'importanza dei mitocondri nella progressione tumorale, essi costituiscono il bersaglio della presente tesi sperimentale e rappresentano un approccio terapeutico innovativo. Questa tesi presenta l'analisi preclinica *in vitro* di 7 nuovi composti citotossici, denominati PV1-7. L'efficacia di tali molecole sperimentali è stata valutata su linee cellulari consolidate di glioblastoma umano (T98G e U-87 MG) e murino (GL261), utilizzando astrociti primari di ratto e fibroblasti umani come controlli per saggiare la tossicità dei composti sui tessuti sani. Le analisi, condotte mediante spettrofluorimetria e microscopia confocale, hanno dimostrato che i composti di nuova sintesi sono in grado di attraversare spontaneamente le membrane plasmatiche, localizzandosi selettivamente all'interno dei mitocondri. Inoltre, il saggio di vitalità MTT e la valutazione morfologica hanno evidenziato una marcata citotossicità tempo-dipendente, in particolare per i composti PV3 e PV6. Al contrario, le stesse molecole hanno mostrato un'elevata selettività, non alterando le colture cellulari di astrociti e fibroblasti. Per indagare il potenziale mutageno dei nuovi composti, è stato eseguito il saggio di alchilazione con 4-NBP. I risultati hanno suggerito una spiccata capacità alchilante di PV3 e PV6, simile agli effetti del Temozolomide. Effetti mutageni sono stati confermati anche mediante analisi Long Real-Time PCR sul DNA mitocondriale, in particolare per PV3 e PV6. Inoltre, è stato eseguito il saggio DHE per valutare la funzionalità mitocondriale, evidenziando un marcato stress ossidativo e un accumulo di specie reattive dell'ossigeno (ROS) indotti specificamente da PV1, PV3 e PV6. Il saggio JC-1 ha inoltre documentato l'accumulo di mitocondri depolarizzati nelle cellule tumorali in seguito al trattamento con PV3. A livello ultrastrutturale, l'analisi TEM ha confermato il danno mitocondriale nelle cellule trattate con PV3: gli organelli presentavano una distribuzione anomala delle creste al loro interno. In conclusione, questa analisi preliminare in vitro ha indicato il potenziale di almeno un nuovo composto, ovvero il PV3, di indurre citotossicità nelle cellule tumorali e mutazioni del mtDNA, aprendo la strada ad analisi sperimentali più approfondite.
Analisi pre-clinica di composti sperimentali citotossici, con target sulla funzionalità mitocondriale in modelli cellulari di Glioblastoma Multiforme
GALEOTTI, EMMA
2025/2026
Abstract
Glioblastoma Multiforme (GBM) is the most common and aggressive malignant tumour of the central nervous system, classified as grade IV malignant astrocytoma by World Health Organization (WHO) and characterized by resistance to conventional treatments and rapid cell proliferation. Despite the adoption of conventional therapeutic strategies including surgical resection, radiation therapy and chemotherapy with Temozolomide, the clinical outcome remains poor. There are several reasons underlying this therapeutic failure, as the profound tumour microenvironment heterogeneity, the incapacity of the drugs to fully penetrate the blood-brain barrier and the intrinsic resistance related to glioma stem cells (GSCs). Mitochondria represent key organelles for tumorigenesis; through horizontal mitochondrial transfer, mitochondria DNA hypermutation and Warburg effect, they promote proliferation and surviving of tumoral cells in stress conditions. Considering the importance of mitochondria in tumour progression, they represent the target of this experimental thesis and constitute an innovative therapeutic approach. This thesis presents the preclinical in vitro analysis of 7 novel cytotoxic compounds, named PV1-7. The efficacy of these experimental molecules was tested on established human glioblastoma (T98G and U-87 MG) and murine cells (GL261), employing primary rat astrocytes and human fibroblast as controls to test the toxicity of the compounds on healthy tissues. The analysis achieved through spectrofluorimetric, and confocal microscopy demonstrated that the newly synthetized compounds are able to spontaneously cross plasma membranes, localizing selectively within mitochondria. Furthermore, MTT viability assay and morphological evaluation highlighted a marked, time-dependent cytotoxicity, in particular for PV3 and PV6. Contrarily, the same molecules demonstrated a prominent selectivity, keeping astrocytes and fibroblasts cell cultures unaffected. Investigating the mutagenic potential of the novel compounds, 4-NBP alkylating assay was performed. The results suggested marked alkylating capacity of PV3 and PV6, resembling Temozolomide effects. Mutagenetic effects were also demonstrated by Long Real-Time PCR on mtDNA, particularly for PV3 and PV6. Furthermore, DHE assay was performed, in order to investigate mitochondria functionality, demonstrating a profound oxidative stress and accumulation of reactive oxidative species (ROS) induced specifically by PV1, PV3 and PV6. JC-1 assay also documented the accumulation of depolarized mitochondria following PV3 treatment in tumour cells. At ultrastructural level, TEM observation confirmed mitochondrial damage in PV3-treated cells: organelles displayed abnormal cristae distribution within the organelles. In conclusion, this preliminary in vitro analysis indicated the potentiality of at least one novel compound, i.e. PV3, to induce cytotoxicity in tumour cells and mtDNA mutations, opening to more advanced experimental analysis.| File | Dimensione | Formato | |
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