Analisi delle interazioni molecolari e azione intra-mitocondriale di nuovi composti per il trattamento del glioblastoma

Glioblastoma is among the most aggressive primary malignancies of the central nervous system and remains associated with an unfavorable prognosis in spite of current therapeutic strategies. In this regard, the studies conducted in this thesis investigated the intracellular behaviour and potential molecular targets of a series of novel fluorescent compounds directed towards mitochondria in glioblastoma cell models, named PV1–PV7. Initial fluorescence and confocal microscopy analyses in U-87 MG cells showed predominantly cytoplasmic patterns compatible with mitochondrial network localization; subsequently, imaging flow cytometry assessed compound internalization in glioblastoma and non-tumor cell populations. Among the tested molecules, PV3 showed the largest relative difference in intracellular uptake between glioblastoma cells and normal control cells, being therefore selected for further characterization. High-resolution microscopy conducted with the usage of T98G cells indicated that PV3 accumulated within the mitochondrial compartment, displaying punctate and filamentous intracellular signals. However, limited overlap with mitochondrial nucleoids stained with SYBR Green at low concentration did not support preferential co-localization of PV3 with these sites. The study was therefore extended to alternative mitochondrial macromolecular targets. Gel electrophoresis, fluorescence spectroscopy and fluorimetric assays supported the association of PV3 with mitochondrial material containing RNA and indicated a stronger fluorescence response in the presence of RNA than DNA standards. In agreement with these observations, reverse transcription quantitative PCR analysis showed lower relative amplification efficiencies for the mitochondrial 12S and 16S rRNA targets in cells treated with PV3 compared with untreated controls, although these data do not establish direct RNA alkylation or degradation. The interaction of PV3 with nuclear DNA was additionally investigated using cell preparations enriched in metaphase cells and isolated chromosome preparations. PV3 did not substantially overlap with other probes used, such as Hoechst 33258 or 7-AAD-labelled chromosomal DNA, instead showing a peri-chromosomal distribution. Moreover, following RNase A treatment, the fluorescence pattern of PV3 became more comparable with that of PV5, a structurally related derivative of PV3. Overall, these results support mitochondrial accumulation of PV3 and suggest that its intracellular distribution may involve interactions with structures that contain RNA, including mitochondrial RNA and RNA-associated components of the peri-chromosomal layer. Further studies will be required to identify the molecular binding partners of PV3 and define the functional consequences of these interactions in glioblastoma cells.

Il Glioblastoma è annoverato tra i più aggressivi tumori maligni del sistema nervoso centrale, associato ad una prognosi estremamente non favorevole nonostante le terapie correntemente disponibili. In merito, gli studi condotti in questa tesi hanno investigato il comportamento intracellulare e potenziali bersagli molecolari di una serie di composti di nuova formulazione la cui azione è diretta verso i mitocondri in modelli cellulari tumorali, denominati PV1 a 7. Analisi iniziali di fluorescenza e microscopia confocale condotte usando la linea cellulare U-87 MG hanno mostrato un pattern citoplasmatico prevalentemente compatibile con una localizzazione nel network mitocondriale; successivamente, tecniche di imaging con citofluorimetria hanno aiutato a stabilire l’internalizzazione dei composti in linee cellulari tumorali e non. Tra le molecole testate, PV3 ha dimostrato la differenza relativa nell’assorbimento maggiore tra cellule di glioblastoma e cellule di controllo, ed è stata quindi selezionata come oggetto di maggiori studi. Analisi di microscopia ad alta risoluzione condotte tramite l’utilizzo di cellule T98G hanno indicato che PV3 viene accumulato nel compartimento mitocondriale, mostrando segnali intracellulari di carattere punteggiato e filamentoso. In seguito, però, esperimenti di marcatura con basse concentrazioni di colorante SYBR-GREEN e PV3 hanno mostrato scarsa sovrapposizione tra i due segnali, non supportando una loro co-localizzazione. Gli esperimenti sono stati quindi estesi a bersagli macromolecolari mitocondriali alternativi. Tecniche come l’elettroforesi su gel, spettroscopia a fluorescenza e protocolli di fluorimetria hanno invece supportato un’associazione di PV3 con materiale mitocondriale contenente RNA e hanno indicato una risposta fluorescente di PV3 più forte nel materiale contenente RNA rispetto al DNA. In accordo con tali osservazioni, esperimenti condotti usando RT-qPCR con trascrizione inversa hanno mostrato un’efficienza di amplificazione relativamente più bassa per i componenti 12S e 16S mitocondriali in cellule trattate con PV3 rispetto a controlli non trattati, pur non stabilendo una degradazione o alchilazione diretta della componente di RNA. L’interazione di PV3 con il DNA nucleare è stata poi investigata usando preparati cellulari arricchiti in cellule metafasiche e altri preparati contenenti cromosomi isolati. PV3 non ha mostrato sovrapposizioni degne di nota con altre sonde usate, come Hoechst 33258 o 7-AAD, dimostrando invece una sua distribuzione peri-cromosomica. Inoltre, a seguito di un trattamento di RNAasi, la distribuzione della fluorescenza di PV3 è diventata più simile a quella di PV5, un suo derivato strutturale. Nel complesso, i risultati riportati supportano un accumulo mitocondriale di PV3 e suggeriscono che la sua distribuzione intracellulare potrebbe coinvolgere potenziali interazioni con strutture contenenti RNA, inclusi l’RNA mitocondriale e componenti associati all’RNA facenti parte dell’assemblaggio dello strato peri-cromosomale dei cromosomi metafasici. Ulteriori studi sono perciò necessari per identificare i legami molecolari esatti di PV3 e per definire le conseguenze funzionali di tali interazioni in cellule di glioblastoma.