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The endosomal trafficking system plays a fundamental role in regulating plasma membrane proteins and sorting them for recycling or degradation. In plants, ubiquitinated membrane proteins are recognised by the ESCRT machinery and delivered to the vacuole for degradation. Although the ESCRT pathway is evolutionarily conserved in animals, fungi and plants, the ESCRT-0 complex is absent in higher plants. Instead, TOL (Target of Myb1) proteins act as ubiquitin receptors during the early stages of this pathway. While Arabidopsis thaliana contains nine TOL proteins with partially redundant functions, the liverwort Marchantia polymorpha has only two homologues, MpTOLa and MpTOLb. This reduced genetic redundancy, together with its predominantly haploid life cycle, makes M. polymorpha a useful model for investigating TOL function. MpTOLa is more closely related to AtTOL1/AtTOL2, whereas MpTOLb resembles AtTOL6/AtTOL9. This study aimed to investigate the roles of MpTOLa and MpTOLb by analysing mutant phenotypes. CRISPR/Cas9 vectors containing two guide RNAs per locus were used to introduce mutations into the target genes. Stable mutations maintained after vegetative propagation were identified in two Mptola lines (Mptola-1 and Mptola-2) and three Mptolb lines (Mptolb-5, Mptolb-6 and Mptolb-8). Sequence analysis predicted early frameshift mutations in the Mptola lines, potentially causing loss of function, and mutations leading to C-terminal truncations in the Mptolb lines, retaining the N-terminal core. Their effects on transcript and protein stability and function remain to be experimentally verified. Phenotypic differences were observed between mutant lines and their corresponding wild-type (WT) controls. Both Mptola lines showed reduced size and asymmetric thallus development, including an approximately 90° rotation of one lobe. Mptola-1 also displayed altered rhizoid growth and curled rhizoid tips, whereas Mptola-2 exhibited more vertical, hyponastic growth. Mptolb-5 developed wider lobes, asymmetric thallus growth and an earlier-forming apical notch. Mptolb-6 showed reduced growth and a compact, strongly folded thallus with a pronounced three-dimensional structure. In Mptolb-8, the apical notch was more pronounced than in the WT, and differences in thallus expansion became more evident during later development. Gemma cup formation also differed between mutant and WT plants. The male mutants (Mptola-1 and Mptolb-6) developed gemma cups later than the male WT control Tak-1, whereas the female mutants (Mptola-2, Mptolb-5 and Mptolb-8) developed them earlier than the female WT control Tak-2. These observations suggest that MpTOLa and MpTOLb may contribute to cell polarity, organogenesis and developmental timing in M. polymorpha. Based on known TOL functions in Arabidopsis, altered trafficking of proteins involved in auxin signalling may contribute to the growth phenotypes, while changes in ABA-related trafficking may be associated with differences in gemma cup formation. Both hypotheses require further experimental investigation. A second aim was to generate molecular tools for future complementation experiments using AtTOL1, AtTOL2, AtTOL6 and AtTOL9 to complement M. polymorpha TOL mutants and investigate protein subcellular localisation. Two expression vectors, MpEF1ap::AtTOL2-GFP and MpEF1ap::AtTOL9-GFP, carrying Arabidopsis TOL genes fused to a C-terminal GFP tag under the constitutive MpEF1ap promoter, were successfully assembled. Completing the remaining constructs (MpEF1ap::AtTOL1-GFP, MpEF1ap::AtTOL6-GFP, MpEF1ap::MpTOLa-GFP and MpEF1ap::MpTOLb-GFP) would enable broader comparisons of TOL protein localisation and complementation capacity. Overall, this study provides tools to investigate MpTOLa and MpTOLb functions in plant development and the conservation of TOL-mediated sorting.

plasmatica, indirizzandole verso il riciclo o la degradazione. Nelle piante, le proteine ubiquitinate vengono riconosciute dal complesso ESCRT e indirizzate al vacuolo per la degradazione. Nelle piante superiori, il complesso ESCRT-0 è assente e le proteine TOL (Target of Myb1) svolgono il ruolo di recettori dell'ubiquitina nelle prime fasi della via ESCRT. Mentre Arabidopsis thaliana possiede nove proteine TOL con funzioni parzialmente ridondanti, il muschio epatico Marchantia polymorpha presenta solo due omologhi, MpTOLa e MpTOLb. La ridotta ridondanza genetica e il ciclo vitale prevalentemente aploide rendono questa specie un modello utile per studiarne la funzione. MpTOLa è più strettamente correlata ad AtTOL1/AtTOL2, mentre MpTOLb presenta somiglianze con AtTOL6/AtTOL9. Questo studio mirava a investigare il ruolo di MpTOLa e MpTOLb attraverso l'analisi di linee mutanti generate mediante CRISPR/Cas9, utilizzando due RNA guida per ciascun locus. Sono state identificate mutazioni stabili, mantenute dopo la propagazione vegetativa, in due linee Mptola (Mptola-1 e Mptola-2) e tre linee Mptolb (Mptolb-5, Mptolb-6 e Mptolb-8). Le analisi di sequenza hanno evidenziato mutazioni frameshift precoci nelle linee Mptola, potenzialmente responsabili della perdita di funzione, e mutazioni previste come causa di troncamenti C-terminali nelle linee Mptolb, che mantengono la porzione N-terminale. Le conseguenze sulla stabilità e sulla funzione di trascritti e proteine devono ancora essere verificate. Rispetto ai controlli wild-type (WT), entrambe le linee Mptola erano più piccole e presentavano uno sviluppo asimmetrico del tallo, con una rotazione di circa 90° di uno dei lobi. Mptola-1 mostrava inoltre una crescita alterata dei rizoidi e apici arricciati, mentre Mptola-2 presentava una crescita più verticale e un orientamento iponastico. Mptolb-5 sviluppava lobi più ampi e asimmetrici, con formazione precoce dell'incisione apicale. Mptolb-6 mostrava crescita ridotta e un tallo compatto e ripiegato, con una pronunciata struttura tridimensionale. In Mptolb-8, l'incisione apicale era più accentuata e le differenze nell'espansione del tallo diventavano più evidenti nelle fasi successive. Anche la formazione delle coppe gemmifere differiva tra mutanti e controlli: le linee maschili (Mptola-1 e Mptolb-6) le sviluppavano più tardi rispetto al WT maschile Tak-1, mentre le linee femminili (Mptola-2, Mptolb-5 e Mptolb-8) le sviluppavano prima del WT femminile Tak-2. Questi risultati suggeriscono che MpTOLa e MpTOLb possano contribuire alla polarità cellulare, all'organogenesi e alla tempistica dello sviluppo. Alterazioni nel traffico di proteine coinvolte nella segnalazione dell'auxina potrebbero spiegare i fenotipi di crescita, mentre cambiamenti nel traffico correlato all'ABA potrebbero contribuire alle differenze nella formazione delle coppe gemmifere. Entrambe le ipotesi richiedono ulteriori verifiche sperimentali. Una seconda parte dello studio ha riguardato la generazione di strumenti molecolari per futuri esperimenti di complementazione con AtTOL1, AtTOL2, AtTOL6 e AtTOL9, allo scopo di valutare la capacità delle proteine di Arabidopsis di complementare i fenotipi mutanti e analizzarne la localizzazione subcellulare. Sono stati assemblati i vettori MpEF1ap::AtTOL2-GFP e MpEF1ap::AtTOL9-GFP, contenenti proteine fuse a un tag GFP C-terminale sotto il controllo del promotore costitutivo MpEF1ap. Il completamento dei costrutti MpEF1ap::AtTOL1-GFP, MpEF1ap::AtTOL6-GFP, MpEF1ap::MpTOLa-GFP e MpEF1ap::MpTOLb-GFP permetterebbe confronti più completi. Nel complesso, le linee mutanti e gli strumenti generati costituiscono una base per approfondire il ruolo delle proteine TOL nel traffico endosomiale e nello sviluppo vegetale, nonché la loro conservazione evolutiva.

Mutagenesi mediata da CRISPR/Cas dei geni tola e tolb di Marchantia polymorpha e complementazione delle linee mutanti con i geni tol1, tol2, tol6 e tol9 di Arabidopsis thaliana.

ZAVTUR, NICOLETTA MARIA
2025/2026

Abstract

The endosomal trafficking system plays a fundamental role in regulating plasma membrane proteins and sorting them for recycling or degradation. In plants, ubiquitinated membrane proteins are recognised by the ESCRT machinery and delivered to the vacuole for degradation. Although the ESCRT pathway is evolutionarily conserved in animals, fungi and plants, the ESCRT-0 complex is absent in higher plants. Instead, TOL (Target of Myb1) proteins act as ubiquitin receptors during the early stages of this pathway. While Arabidopsis thaliana contains nine TOL proteins with partially redundant functions, the liverwort Marchantia polymorpha has only two homologues, MpTOLa and MpTOLb. This reduced genetic redundancy, together with its predominantly haploid life cycle, makes M. polymorpha a useful model for investigating TOL function. MpTOLa is more closely related to AtTOL1/AtTOL2, whereas MpTOLb resembles AtTOL6/AtTOL9. This study aimed to investigate the roles of MpTOLa and MpTOLb by analysing mutant phenotypes. CRISPR/Cas9 vectors containing two guide RNAs per locus were used to introduce mutations into the target genes. Stable mutations maintained after vegetative propagation were identified in two Mptola lines (Mptola-1 and Mptola-2) and three Mptolb lines (Mptolb-5, Mptolb-6 and Mptolb-8). Sequence analysis predicted early frameshift mutations in the Mptola lines, potentially causing loss of function, and mutations leading to C-terminal truncations in the Mptolb lines, retaining the N-terminal core. Their effects on transcript and protein stability and function remain to be experimentally verified. Phenotypic differences were observed between mutant lines and their corresponding wild-type (WT) controls. Both Mptola lines showed reduced size and asymmetric thallus development, including an approximately 90° rotation of one lobe. Mptola-1 also displayed altered rhizoid growth and curled rhizoid tips, whereas Mptola-2 exhibited more vertical, hyponastic growth. Mptolb-5 developed wider lobes, asymmetric thallus growth and an earlier-forming apical notch. Mptolb-6 showed reduced growth and a compact, strongly folded thallus with a pronounced three-dimensional structure. In Mptolb-8, the apical notch was more pronounced than in the WT, and differences in thallus expansion became more evident during later development. Gemma cup formation also differed between mutant and WT plants. The male mutants (Mptola-1 and Mptolb-6) developed gemma cups later than the male WT control Tak-1, whereas the female mutants (Mptola-2, Mptolb-5 and Mptolb-8) developed them earlier than the female WT control Tak-2. These observations suggest that MpTOLa and MpTOLb may contribute to cell polarity, organogenesis and developmental timing in M. polymorpha. Based on known TOL functions in Arabidopsis, altered trafficking of proteins involved in auxin signalling may contribute to the growth phenotypes, while changes in ABA-related trafficking may be associated with differences in gemma cup formation. Both hypotheses require further experimental investigation. A second aim was to generate molecular tools for future complementation experiments using AtTOL1, AtTOL2, AtTOL6 and AtTOL9 to complement M. polymorpha TOL mutants and investigate protein subcellular localisation. Two expression vectors, MpEF1ap::AtTOL2-GFP and MpEF1ap::AtTOL9-GFP, carrying Arabidopsis TOL genes fused to a C-terminal GFP tag under the constitutive MpEF1ap promoter, were successfully assembled. Completing the remaining constructs (MpEF1ap::AtTOL1-GFP, MpEF1ap::AtTOL6-GFP, MpEF1ap::MpTOLa-GFP and MpEF1ap::MpTOLb-GFP) would enable broader comparisons of TOL protein localisation and complementation capacity. Overall, this study provides tools to investigate MpTOLa and MpTOLb functions in plant development and the conservation of TOL-mediated sorting.
2025
CRISPR/Cas-Mediated Mutagenesis of Marchantia polymorpha tola and tolb and Complementation of the mutant lines with Arabidopsis thaliana tol1, tol2, tol6, and tol9 genes.
plasmatica, indirizzandole verso il riciclo o la degradazione. Nelle piante, le proteine ubiquitinate vengono riconosciute dal complesso ESCRT e indirizzate al vacuolo per la degradazione. Nelle piante superiori, il complesso ESCRT-0 è assente e le proteine TOL (Target of Myb1) svolgono il ruolo di recettori dell'ubiquitina nelle prime fasi della via ESCRT. Mentre Arabidopsis thaliana possiede nove proteine TOL con funzioni parzialmente ridondanti, il muschio epatico Marchantia polymorpha presenta solo due omologhi, MpTOLa e MpTOLb. La ridotta ridondanza genetica e il ciclo vitale prevalentemente aploide rendono questa specie un modello utile per studiarne la funzione. MpTOLa è più strettamente correlata ad AtTOL1/AtTOL2, mentre MpTOLb presenta somiglianze con AtTOL6/AtTOL9. Questo studio mirava a investigare il ruolo di MpTOLa e MpTOLb attraverso l'analisi di linee mutanti generate mediante CRISPR/Cas9, utilizzando due RNA guida per ciascun locus. Sono state identificate mutazioni stabili, mantenute dopo la propagazione vegetativa, in due linee Mptola (Mptola-1 e Mptola-2) e tre linee Mptolb (Mptolb-5, Mptolb-6 e Mptolb-8). Le analisi di sequenza hanno evidenziato mutazioni frameshift precoci nelle linee Mptola, potenzialmente responsabili della perdita di funzione, e mutazioni previste come causa di troncamenti C-terminali nelle linee Mptolb, che mantengono la porzione N-terminale. Le conseguenze sulla stabilità e sulla funzione di trascritti e proteine devono ancora essere verificate. Rispetto ai controlli wild-type (WT), entrambe le linee Mptola erano più piccole e presentavano uno sviluppo asimmetrico del tallo, con una rotazione di circa 90° di uno dei lobi. Mptola-1 mostrava inoltre una crescita alterata dei rizoidi e apici arricciati, mentre Mptola-2 presentava una crescita più verticale e un orientamento iponastico. Mptolb-5 sviluppava lobi più ampi e asimmetrici, con formazione precoce dell'incisione apicale. Mptolb-6 mostrava crescita ridotta e un tallo compatto e ripiegato, con una pronunciata struttura tridimensionale. In Mptolb-8, l'incisione apicale era più accentuata e le differenze nell'espansione del tallo diventavano più evidenti nelle fasi successive. Anche la formazione delle coppe gemmifere differiva tra mutanti e controlli: le linee maschili (Mptola-1 e Mptolb-6) le sviluppavano più tardi rispetto al WT maschile Tak-1, mentre le linee femminili (Mptola-2, Mptolb-5 e Mptolb-8) le sviluppavano prima del WT femminile Tak-2. Questi risultati suggeriscono che MpTOLa e MpTOLb possano contribuire alla polarità cellulare, all'organogenesi e alla tempistica dello sviluppo. Alterazioni nel traffico di proteine coinvolte nella segnalazione dell'auxina potrebbero spiegare i fenotipi di crescita, mentre cambiamenti nel traffico correlato all'ABA potrebbero contribuire alle differenze nella formazione delle coppe gemmifere. Entrambe le ipotesi richiedono ulteriori verifiche sperimentali. Una seconda parte dello studio ha riguardato la generazione di strumenti molecolari per futuri esperimenti di complementazione con AtTOL1, AtTOL2, AtTOL6 e AtTOL9, allo scopo di valutare la capacità delle proteine di Arabidopsis di complementare i fenotipi mutanti e analizzarne la localizzazione subcellulare. Sono stati assemblati i vettori MpEF1ap::AtTOL2-GFP e MpEF1ap::AtTOL9-GFP, contenenti proteine fuse a un tag GFP C-terminale sotto il controllo del promotore costitutivo MpEF1ap. Il completamento dei costrutti MpEF1ap::AtTOL1-GFP, MpEF1ap::AtTOL6-GFP, MpEF1ap::MpTOLa-GFP e MpEF1ap::MpTOLb-GFP permetterebbe confronti più completi. Nel complesso, le linee mutanti e gli strumenti generati costituiscono una base per approfondire il ruolo delle proteine TOL nel traffico endosomiale e nello sviluppo vegetale, nonché la loro conservazione evolutiva.
PINNOLA, ALBERTA
KORBEI, BARBARA
Lauree Magistrali
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Nicoletta Maria Zavtur - Tesi Magistrale.pdf

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Descrizione: La tesi indaga il ruolo delle proteine TOL nel traffico endosomiale e nello sviluppo di M. polymorpha, caratterizzando linee mutanti generate con CRISPR/Cas9 e sviluppando strumenti molecolari per futuri studi di complementazione con geni di A. thaliana.
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/20.500.14239/37387