Indagine sulla ferroptosi come meccanismo di morte indotto dall’asparaginasi: uno studio in vitro sulla linea cellulare RS4;11 della leucemia linfoblastica acuta

B-cell Acute Lymphoblastic Leukemia (B-ALL) characterized by the KMT2A gene rearrangement represents one of the most aggressive pediatric tumor subtypes, known for its rapid progression and marked resistance to classic cell death mechanisms induced by conventional therapies, such as apoptosis. To overcome this obstacle, current research is increasingly focusing on exploring the metabolic vulnerabilities of tumors, seeking their intrinsic weak points. Among these, the profound dependence of these specific leukemic cells on the extracellular supply of two fundamental amino acids, asparagine (Asn) and glutamine (Gln), stands out as a consequence of the genetic silencing of the asparagine synthetase enzyme. This thesis work fits precisely into this innovative framework, aiming to investigate the molecular mechanisms underlying the cytotoxic action of L-asparaginase. Previously, through a scRNA-seq analysis on the B-ALL cell line RS4;11, our laboratory observed an enrichment in the expression of genes involved in the ferroptosis pathway following treatment. Thus, this study was designed as a first functional validation of these transcriptomic results. From an experimental perspective, the study was conducted in vitro using the leukemic cell line RS4;11, a validated model characterized by high sensitivity to asparagine starvation. Cell cultures were exposed for 72 hours to a biologically relevant concentration (0.01 U/ml) of the recombinant enzyme variant N24S EcAII, specifically engineered to resist degradation by lysosomal proteases and ensure prolonged cytotoxic activity. This drug acts as a potent depleting agent, hydrolyzing asparagine and glutamine from the cellular microenvironment and triggering severe intracellular nutritional stress. To evaluate the impact of this prolonged stress, cells were lysed, and the protein content was accurately quantified using a BCA assay. Subsequently, via SDS-PAGE electrophoresis and Western Blot analysis, the protein expression of eight main targets associated with oxidative stress, iron metabolism, and the antioxidant defense axis was investigated. The objective was to verify whether nutritional deprivation could drive leukemic blasts toward a specific non-apoptotic cell death mechanism: ferroptosis. Ferroptosis is a highly regulated process strictly dependent on redox-active intracellular iron, and it is characterized by the lethal accumulation of lipid peroxides at the membrane level. Results demonstrated that the enzyme's action triggers a true lethal short circuit that goes well beyond simply "starving" the cell. By depleting glutamine, the drug deprives the cell of the precursor required to synthesize glutamate. This cascaded into functionally blocking the cellular cystine import system (System Xc-) and, consequently, halting glutathione production. Without this crucial element, densitometric analysis revealed that GPX4, the primary and most powerful antioxidant shield defending cell membranes, undergoes a drastic and significant collapse. Confirming this massive oxidative stress, the degradation of the inhibitory sensor KEAP1 was also observed. The data further reveal the cell's desperate, and futile, attempt to survive this metabolic cataclysm. To defend itself against the accumulation of free radicals, the leukemic cell attempts to isolate intracellular iron (the primary catalyst of ferroptosis) by reducing the influx of new metal via the DMT1 transporter, while simultaneously increasing ferritin (FTH1) production to sequester the existing pool. Concurrently, it halts lysosomal iron recycling through the complete abrogation of the NCOA4 receptor protein. However, these extreme adaptive measures fail: oxidative damage to membrane lipids propagates through a chain reaction that is too rapid and irreparable, ultimately condemning the cell to a definitive ferroptotic collapse.

La leucemia linfoblastica acuta a cellule B (B-ALL), caratterizzata dal riarrangiamento del gene KMT2A, rappresenta uno dei sottotipi tumorali pediatrici più aggressivi, noto per la sua rapida progressione e per la resistenza ai classici meccanismi di morte cellulare indotti dalle terapie convenzionali, come l’apoptosi. Per superare questo ostacolo, la ricerca attuale si sta concentrando sull’esplorazione delle vulnerabilità metaboliche dei tumori, alla ricerca dei loro punti deboli intrinseci. Tra questi, spicca la profonda dipendenza di queste specifiche cellule leucemiche dall’apporto extracellulare di due aminoacidi fondamentali, l’asparagina (Asn) e la glutammina (Gln), conseguenza del silenziamento genetico dell’enzima asparagina sintetasi. Il presente lavoro di tesi si inserisce in questo quadro innovativo, con l’obiettivo di indagare i meccanismi molecolari alla base dell’azione citotossica della L-asparaginasi. In precedenza, attraverso un’analisi scRNA-seq sulla linea cellulare RS4;11 di B-ALL, il nostro laboratorio aveva osservato un arricchimento nell’espressione dei geni coinvolti nella via della ferroptosi a seguito del trattamento. Pertanto, questo studio è stato concepito come una prima validazione funzionale di tali risultati trascrittomici. Dal punto di vista sperimentale, lo studio è stato condotto in vitro utilizzando la linea cellulare leucemica RS4;11, un modello convalidato caratterizzato da un’elevata sensibilità alla privazione di asparagina. Le colture cellulari sono state esposte per 72 ore a una concentrazione biologicamente rilevante (0,01 U/ml) della variante enzimatica ricombinante N24S EcAII, specificamente ingegnerizzata per resistere alla degradazione da parte delle proteasi lisosomiali e garantire un’attività citotossica prolungata. Questo farmaco agisce come un potente agente depletante, idrolizzando l’asparagina e la glutammina dal microambiente cellulare e innescando stress nutrizionale intracellulare. Per valutare l’impatto di questo stress, le cellule sono state lisate e il contenuto proteico è stato quantificato mediante un saggio BCA. Successivamente, tramite elettroforesi SDS-PAGE e analisi Western Blot, è stata studiata l’espressione proteica di otto bersagli principali associati allo stress ossidativo, al metabolismo del ferro e all’asse di difesa antiossidante. L’obiettivo era verificare se la deprivazione nutrizionale potesse indurre i blasti leucemici verso uno specifico meccanismo di morte cellulare non apoptotico: la ferroptosi. La ferroptosi è un processo altamente regolato che dipende strettamente dal ferro intracellulare redox-attivo ed è caratterizzato dall'accumulo letale di perossidi lipidici a livello della membrana. I risultati hanno dimostrato che l’azione dell’enzima innesca un vero e proprio cortocircuito letale che va ben oltre il semplice “affamare” la cellula. Esaurendo la glutammina, il farmaco priva la cellula del precursore necessario per sintetizzare il glutammato. Ciò ha provocato un blocco funzionale del sistema di importazione cellulare della cistina (Sistema Xc-) e, di conseguenza, l’arresto della produzione di glutatione. Senza questo elemento, l’analisi densitometrica ha rivelato che la GPX4, lo scudo antiossidante principale e più potente a difesa delle membrane cellulari, subisce un significativo collasso. A conferma di questo massiccio stress ossidativo, è stata osservata anche la degradazione del sensore inibitorio KEAP1. I dati rivelano inoltre il tentativo disperato, e vano, della cellula di sopravvivere a questo cataclisma metabolico. Per difendersi dall’accumulo di radicali liberi, la cellula leucemica cerca di isolare il ferro intracellulare (il principale catalizzatore della ferroptosi) riducendo l’afflusso di nuovo metallo tramite il trasportatore DMT1, aumentando al contempo la produzione di ferritina (FTH1) per sequestrare le riserve esistenti. NCOA4 non rilevato.