Ingegnerizzazione di un biosensore per l'ABA ottimizzato per i mammiferi mediante mutagenesi mirata del recettore PYL1

Abscisic acid (ABA) is a plant stress hormone that is also active in mammals, where it has been linked to glucose regulation, inflammation and remyelination, yet endogenous concentrations lie in the low-nanomolar range. The first-generation mammalian biosensor couples ABA-dependent dimerisation of the plant receptor PYL1(H87P) with its co-receptor ABI1 to a luciferase reporter, but is limited by modest output per binding event and by a persistent signal in untreated cells. Two objectives were pursued: introducing ABACUS2 substitutions (S112A, A190V, E141D, R143S) into the PYL1(H87P) sensory domain by overlap-extension mutagenesis, and characterising the second-generation reporter line already established in the laboratory by dual-luciferase assay. A sequence-confirmed PYL1(H87P)-S112A-A190V double mutant was obtained in three independent clones, by assembling the half-fragments directly with the linearised vector using BstXI outer primers; E141D and R143S, associated with the largest affinity gains, were not incorporated before the placement ended. A diagnostic reaction reproduced the smear with no fusion junction present, identifying reuse of an outer primer on a template already carrying its binding site as one contributor; colony PCR alone proved insufficient evidence of a correct clone. The reporter responded log-linearly between 97.7 nM and 25 µM ABA (R² = 0.887, 14 points) and saturated between 25 and 50 µM. Seven independently isolated clones differed by up to 2.8-fold in fold induction at 40 nM (17.7 to 49.8), which sets a floor for any comparison between sensor variants. Seed extracts raised the reporter ratio above blank, but all fell below the lowest standard and Renilla signal was suppressed in extract wells; the data are consistent with ABA but establish neither its presence nor its concentration. The mutant was confirmed too late to be transfected, so the engineering hypothesis remains untested; the construct, the calibrated range and the clone-to-clone variability define how the next variants should be built and compared.

L'acido abscissico (ABA) è un ormone vegetale dello stress attivo anche nei mammiferi, dove è stato associato alla regolazione del glucosio, all'infiammazione e alla rimielinizzazione; le concentrazioni endogene si collocano tuttavia nell'ordine dei bassi nanomolari. Il biosensore mammifero di prima generazione accoppia la dimerizzazione ABA-dipendente del recettore vegetale PYL1(H87P) con il suo co-recettore ABI1 a un reporter a luciferasi, ma è limitato da un modesto output per evento di legame e da un segnale persistente nelle cellule non trattate. Sono stati perseguiti due obiettivi: introdurre nel dominio sensoriale di PYL1(H87P), mediante mutagenesi per overlap-extension, le sostituzioni del programma ABACUS2 (S112A, A190V, E141D, R143S), e caratterizzare mediante saggio a doppia luciferasi la linea reporter di seconda generazione già disponibile in laboratorio. Un doppio mutante PYL1(H87P)-S112A-A190V confermato mediante sequenziamento è stato ottenuto in tre cloni indipendenti, assemblando i semi-frammenti direttamente con il vettore linearizzato e impiegando primer esterni BstXI; E141D e R143S, associate ai maggiori incrementi di affinità, non sono state introdotte prima della conclusione del tirocinio. Una reazione diagnostica ha riprodotto lo smear in assenza di una giunzione di fusione, individuando nel riutilizzo di un primer esterno su uno stampo che già presentava il suo sito di legame uno dei fattori responsabili; inoltre, la sola PCR su colonia si è rivelata una prova insufficiente della correttezza di un clone. Il reporter ha risposto in modo log-lineare tra 97,7 nM e 25 µM di ABA (R² = 0,887, 14 punti), con saturazione tra 25 e 50 µM. Sette cloni isolati indipendentemente differivano fino a 2,8 volte nell'induzione a 40 nM (da 17,7 a 49,8), il che fissa un limite inferiore per qualsiasi confronto tra varianti del sensore. Gli estratti di semi hanno aumentato il rapporto del reporter rispetto al bianco, ma tutti si collocavano al di sotto dello standard più basso e il segnale Renilla risultava ridotto nei pozzetti con estratto; i dati sono compatibili con la presenza di ABA, ma non ne dimostrano né la presenza né la concentrazione. Il mutante è stato confermato troppo tardi per essere trasfettato, pertanto l'ipotesi ingegneristica rimane non verificata; il costrutto, l'intervallo calibrato e la variabilità misurata tra cloni definiscono come costruire e confrontare le prossime varianti.