Studio della DNA elicasi RUVBL1 nella riparazione del DNA: interazione con PCNA.

La cellula ha sviluppato diversi metodi che risolvono il problema dei danni al DNA. Tra questi, Il processo di riparazione del DNA per escissione di nucleotidi (Nucleotide excision repair, NER) svolge un ruolo importante per rimuovere danni al DNA che alterano la struttura della doppia elica del DNA. Il NER è mediato da numerose proteine, circa una trentina, che interagendo tra di solo sono in grado di riconoscere ed eliminare un vasto numero di lesioni che alterano la struttura del DNA. Le fasi principali di tale processo sono: 1. riconoscimento della distorsione dell’elica di DNA; 2. reclutamento del complesso pre-incisione; 3. incisione del frammento e rimozione dei nucleotidi danneggiati 4. sintesi di un nuovo frammento di DNA, 5. ligazione in cui viene unito al restante filamento di DNA. Nella fase di sintesi, la proteina PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) svolge un ruolo vitale di supporto per diversi enzimi (tra cui le DNA polimerasi d ed e) coinvolti in questo processo. Nel laboratorio in cui è stato svolto questo lavoro di tesi, vengono studiate le proteine che interagiscono con PCNA durante il NER. Tra queste è stata individuata una DNA elicasi chiamata RUVBL1 e un l’obiettivo della tesi è capire se RUVBL1 partecipa al NER e se questa proteina interagisce con PCNA. Gli esperimenti sono stati condotti principalmente su colture di fibroblasti umani nei quali il processo di replicazione è stato bloccato inducendo una fase di quiescenza proliferativa mediante deprivazione di siero, così da individuare le proteine presenti solo nel processo riparazione. L’esposizione delle cellule a radiazioni UV-C produce danni al DNA localizzati; mediante immunofluorescenza con anticorpi specifici che vadano a legare specificatamente RUVBL1 si è visto che questa proteina localizza proprio nei siti danneggiati. Un risultato importante è stato quello di capire che la proteina RuvBL1 avesse un ruolo nella riparazione dei danni al DNA indotti da radiazione UV, rimossi principalmente dal NER. A questo scopo l’espressione di RUVBL1 è stata silenziata mediante “RNA interference”. E’ stato possibile verificare che, mediante l’incorporazione di 5-Etinil-2’-deossiuridina (EdU), la riparazione del danno nei campioni in cui RuvBL1 era stata silenziata, era meno efficiente rispetto a quelli in cui l’espressione di RuvBL1 era normale. Tra le tecniche che consentono di comprendere se avviene un’interazione tra proteine, nell’ambito della tesi sono state: il saggio di ligazione in prossimità (Proximity Ligation Assays, PLA) e l’immunoprecipitazione (IP). La PLA è stata condotta usando anticorpi che andassero a legare le proteine target: in questo caso PCNA e RUVBL1. Il saggio ha permesso di osservare mediante microscopia in fluorescenza la presenza di spot che rivelano che le proteine di interesse erano ad una distanza inferiore a 40 nanometri e localizzate sul danno. A conferma del risultato precedentemente ottenuto, un ulteriore prova è stata fornita dalla tecnica dell’immunoprecipitazione, svolta mediante l’utilizzo di un anticorpo specifico per RuvBL1. L’esperimento ha confermato la capacità di PCNA di interagire con RuvBL1; l’analisi ottenuta mediante Western Blot ha evidenziato la presenza della proteina. I risultati delle prove sperimentali permettono quindi di affermare che la proteina RuvBL1 interagisce con PCNA durante la riparazione del DNA per escissione di nucleotidi, e che RUVBL1 svolge un ruolo secondario, ma necessario per un completo processo di riparazione mediato dal NER.