Engineering flocculation in an ethanol-producing strain of Escherichia coli

Biomass separation is a major bottleneck in industrial-scale fermentation processes. This study addresses the sustainable valorization of dairy waste through biotechnological approaches by introducing a genetic strategy to confer flocculation capability to an Escherichia coli strain engineered for ethanol production. Two distinct approaches were developed: the first is based on the expression of an elastin-like polypeptide (ELP), a synthetic biopolymer composed of repeating pentapeptide motifs that undergo reversible phase separation, enriched in lysine residues and displayed on the outer membrane via the EhaA autotransporter (referred to throughout this thesis as the Lys system or Lys construct); the second, referred as the bcsB construct, involves the overexpression of the native bcsB gene, associated with vesicle secretion and extracellular matrix regulation. The Lys and bcsB based strategies were implemented by constructing new gene expression platforms under the control of a homoserine lactone (HSL)-inducible promoter. Both systems were initially evaluated using standardized sedimentation assays under various growth and induction conditions. The Lys system exhibited a fast and tunable flocculation response upon induction by HSL, promoting effective and reversible cell aggregation. Conversely, the bcsB-based construct showed some aggregating behavior but resulted in a weaker phenotype, strongly dependent on sugar availability in the medium, with variability too high to justify inclusion in fermentation studies. Sedimentation performance together with microscopy experiments, in which a staining technique able to mark damaged membranes was adopted, were used to evaluate the optimal HSL concentration to guarantee flocculation without compromising bacterial viability. Fermentation tests conducted with the Lys system, under both batch and turbidostat conditions, confirmed that induced flocculation does not impair ethanol production yield. Final ethanol titers exceeded 17 g L, representing approximately 80% of the maximum theoretical yield. Additionally, cell aggregation improved post-fermentation sedimentation, facilitating biomass recovery, as demonstrated by filtration assays. The modular and controllable implementation of flocculation in industrial E. coli strains represents a promising strategy to improve the efficiency of fermentation processes, particularly in terms of sustainability and waste substrate utilization. The results obtained lay the groundwork for future integrated optimization of bioprocesses within biorefinery applications.

La separazione della biomassa rappresenta uno dei principali colli di bottiglia nei processi fermentativi su scala industriale. Questo lavoro si inserisce nel contesto della valorizzazione sostenibile degli scarti lattiero-caseari attraverso approcci biotecnologici, proponendo una strategia genetica per conferire capacità di flocculazione a un ceppo di Escherichia coli ingegnerizzato per la produzione di etanolo. Sono stati sviluppati due approcci distinti: il primo si basa sull’espressione di un polipeptide simile all’elastina (ELP), un biopolimero sintetico costituito da motivi pentapeptidici ripetuti in grado di subire separazione di fase reversibile, arricchito in residui di lisina ed esposto sulla membrana esterna tramite l’autotrasportatore EhaA; il secondo si fonda sulla sovraespressione del gene endogeno bcsB, implicato nella secrezione di vescicole e alla regolazione della matrice extracellulare. Entrambe le strategie sono state implementate mediante la costruzione di nuove piattaforme di espressione genica sotto il controllo di un promotore inducibile da omoserina lattone (HSL). I sistemi sono stati inizialmente valutati tramite saggi di sedimentazione standardizzati, condotti in diverse condizioni di crescita e induzione. Il sistema basato sull’ELP ha mostrato una risposta rapida e modulabile all’induzione con HSL, promuovendo un’aggregazione cellulare efficace e reversibile, senza compromettere la vitalità batterica né l’efficienza del processo fermentativo. Al contrario, il sistema basato su bcsB ha evidenziato un comportamento aggregante più debole, fortemente dipendente dalla disponibilità di zuccheri nel terreno, con una variabilità eccessiva per essere considerato nei successivi studi di fermentazione. Le prestazioni in termini di sedimentazione, insieme a esperimenti di microscopia in cui è stata utilizzata una colorazione specifica per membrane danneggiate, sono state impiegate per individuare la concentrazione ottimale di HSL in grado di garantire la flocculazione senza compromettere la vitalità cellulare. Le prove di fermentazione condotte con il sistema basato sull’ELP, sia in condizioni batch che in turbidostat, hanno confermato che l’induzione della flocculazione non compromette la resa in etanolo. I titoli finali hanno superato i 17 g L, corrispondenti a circa l’80% del rendimento teorico massimo. Inoltre, l’aggregazione cellulare ha migliorato la sedimentazione post-fermentativa, facilitando il recupero della biomassa, come dimostrato da saggi di filtrazione. In conclusione, l’implementazione modulare e controllabile della flocculazione in ceppi industriali di E. coli rappresenta una strategia promettente per migliorare l’efficienza dei processi fermentativi, in particolare in termini di sostenibilità e valorizzazione di substrati di scarto. I risultati ottenuti pongono le basi per future ottimizzazioni integrate di bioprocessi nell’ambito delle applicazioni bioraffineristiche.