Sviluppo di una piattaforma fotofabbricata otticamente compatibile per la caratterizzazione funzionale di organoidi cardiaci umani 3D

Cardiovascular diseases (CVDs) remain the leading cause of mortality worldwide, and their study is limited by the inability of conventional two-dimensional and animal models to meaningfully recapitulate pivotal aspect of human cardiac tissue structure and function. Human induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-derived cardiac organoids (cardioids) capture key aspects of early heart morphogenesis. However, the quantification of mechanical forces generated by cardioids is limited by the lack of dedicated substrates that are both mechanically compliant (1-10 kPa) and compatible with high-resolution imaging techniques. This thesis develops an optically compatible hydrogel platform by adapting a photopatterning gelatin methacrylate (GelMA) workflow from the Synthetic Physiology Lab (SPL) to low-molecular weight (575 Da) polyethylene glycol diacrylate (PEGDA). Compared to GelMA, PEGDA is lower cost and intrinsically non-bioadhesive, helping preserve cardioid integrity by reducing adhesion-driven disaggregation. The concentrations of PEGDA (7.5% w/w), the photoinitiator (lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphospinate, LAP, 1 mg mL-1), and the ultraviolet (UV) absorber tartrazine (1 mg mL-1) were systematically optimized to maintain optical clarity and to define polymerization depth as a function of UV exposure dose (3-15 mJ mm-2). Grayscale-controlled photopolymerization produced three-dimensional cavities (~500 µm in diameter and ~300 µm depth) whose geometry and gel thickness enabled passive, reproducible positioning of single cardioids. The hydrogel thickness at the cavity bottom was designed to remain thin (<100 µm) to support high-resolution imaging and enabled the observation of cardioid-induced substrate deformations, indicating the feasibility of Traction Force Microscopy (TFM)-based mechanical readouts. The rapid, maskless workflow is compatible with standard 384-well plates, supporting scalable high-throughput screening (HTS) studies of cardiac development, disease, and therapeutic response.

Le malattie cardiovascolari (CVDs) rappresentano la principale causa di mortalità a livello mondiale e il loro studio è limitato dall’inadeguatezza dei modelli sperimentali tradizionali. In particolare, i modelli bidimensionali e i modelli animali non sono in grado di ricapitolare in modo fedele la struttura tridimensionale e la funzionalità del tessuto cardiaco umano. In questo contesto, gli organoidi cardiaci derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC), noti come cardioidi, riproducono aspetti chiave della morfogenesi cardiaca. Tuttavia, la quantificazione delle forze meccaniche generate dai cardioidi è limitata a causa della mancanza di substrati dedicati che siano al contempo meccanicamente deformabili (1-10 kPa) e compatibili con tecniche di imaging ad alta risoluzione. In questa tesi viene sviluppata una piattaforma di idrogel compatibile con microscopia ad alta risoluzione adattando un processo di fotopatterning basato su gelatina metacrilata (GelMA) e sviluppato presso il Synthetic Physiology Lab (SPL), al polietileneglicole diacrilato (PEGDA) a basso peso molecolare (575 Da). Rispetto al GelMA, il PEGDA presenta un costo inferiore ed è intrinsecamente non bioadesivo, in modo da preservare l’integrità strutturale dei cardioidi riducendo fenomeni di disaggregazione indotti dall’adesione al substrato. Le concentrazioni di PEGDA (7.5% w/w), del fotoiniziatore (litio fenil-2,4,6-trimetilbenzoylfosfinato, LAP, 1 mg mL-1) e dell’assorbitore ultravioletto (UV) tartrazina (1 mg mL-1) sono state ottimizzate in modo sistematico per garantire un’elevata trasparenza ottica e controllare la profondità di polimerizzazione in funzione della dose di esposizione (3-15 mJ mm-2). La fotopolimerizzazione controllata tramite modulazione in scala di grigi ha consentito la realizzazione di cavità tridimensionali (~500 µm di diametro e ~300 µm di profondità), la cui geometria e lo spessore del gel permettono il posizionamento passivo e riproducibile di singoli cardioidi. Lo spessore dell’idrogel sul fondo delle cavità è stato progettato per rimanere sottile (<100 µm), così da consentire l’imaging ad alta risoluzione e l’osservazione di deformazioni del substrato indotte dai cardioidi, suggerendo la fattibilità di readout meccanici basati su Traction Force Microscopy (TFM). L’intero processo di fabbricazione è stato realizzato su piastre a 384 pozzetti ed è sufficientemente rapido da poter supportare screening ad alto rendimento (HTS), costituendo quindi una promettente piattaforma biomimetica per lo studio dello sviluppo cardiaco, delle patologie e della risposta terapeutica.